活性导向分离瓜蒌皮中具有抗血管紧张素转化酶作用的成分

王辉俊++柯樱++叶冠

[摘要]该试验基于活性导向分离瓜蒌皮中具有抗血管紧张素转化酶（ACE）作用的成分。瓜蒌皮经水提醇沉后取上清液，然后透析截留获1 000以上的部分得GLP，GLP经活性跟踪测定，DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂分离和Superdex75系列凝胶纯化后得GLP11，并对GLP11进行HPGPC分析、单糖组成测定和ACE抑制活性检测。结果显示，采用活性跟踪方法，从瓜蒌皮中得到一种具有ACE抑制作用的均一低聚糖GLP11，相对分子质量为1 367，主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，3种单糖的摩尔比为02∶43∶100，GLP11表现出较强的ACE抑制活性，其IC50为（1134±86） mg·L-1。从瓜蒌皮中成功分离到具有ACE抑制作用的低聚糖，该发现为瓜蒌皮的化学物质基础提供依据。

[关键词]瓜蒌皮； 低聚糖； 活性导向分离； 血管紧张素转化酶（ACE）抑制作用

Bioactivityguided isolation of antiangiotensin converting

enzyme constituents from Trichosanthis Pericarpium

WANG Huijun， KE Ying， YE Guan*

（Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

[Abstract]To isolate the antiangiotensin converting enzyme （ACE） constituents from Trichosanthis Pericarpium based on bioactivityguided separation Trichosanthis Pericarpium was extracted with boiling water and precipitated by ethanol， then its supernatant was collected and dialyzed The retentate of the fractions above 1 000 was lyophilized to obtain GLP， which was then successively separated by DEAE Sepharose fast flow anionexchange and Superdex75 gel permeation chromatographic steps to achieve GLP11 A combination of HPGPC， monosaccharide compositions determination and ACE inhibitory activity studies was performed to investigate the structure and bioactivity The results showed that an antiangiotensin converting enzyme oligosaccharide， GLP11， was obtained from Trichosanthis Pericarpium based on activity tracking， whose average molecular weight was estimated to 1 367； mainly composed of arabinose， mannose， and glucose at a ratio of 02∶43∶100 GLP11 showed potent antiangiotensin converting enzyme effect with the IC50of （1134±86） mg·L-1 In this study， an oligosaccharide with antiangiotensin converting enzyme effect was isolated from Trichosanthis Pericarpium， which could lay the foundation for the substance basis study of Trichosanthis Pericarpium.

[Key words]Trichosanthis Pericarpium； oligosaccharide； activityguided isolation； anti angiotensin converting enzyme （ACE） effect

瓜蒌皮Trichosanthis Pericarpium为葫芦科栝楼属植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim或双边栝楼T rosthorinii Harms的干燥成熟果皮[1]。瓜蒌皮注射液为上药集团旗下子公司上海第一生化药业有限公司独家产品，是以瓜蒌皮为原料，经水提醇沉，再经过离子交换树脂洗脱而制成的灭菌水溶液，临床上用于冠心病，稳定型心绞痛的治疗，具有行气除满，开胸除痹之功效[2]。瓜蒌皮注射液临床应用广泛，但物质基础尚不明确。目前对瓜蒌皮的化学成分研究也主要集中在小分子上，如从瓜蒌皮中分离出脂肪酸[3]、甾醇[45]、黄酮[6]、氨基酸[7]、核苷酸[8]和生物碱[910]成分，但瓜蒌皮聚糖类成分却鲜有报道。肾素血管紧张素系统（RAS）和激肽释放酶激肽系统（KKS）对机体血压、电解质和体液平衡的维持都起着重要的作用。在RASKKS系统中血管紧张素转化酶（ACE）起着至关重要的作用，ACE能催化血管紧张素I（angiotensin I，Ang I）转变为强效升高血压作用的物质血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ），与此同时，还将具有降压作用物质舒缓激肽（bradykinin）降解，使之失去降压作用，从而参与血压调节[1112]。大规模临床试验数据显示，血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）类药物能显著降低冠心病患者的死亡率和再发主要心血管事件的风险[13]。鉴于此，本文将瓜蒌皮按照瓜蒌皮注射液国家药品标准进行提取，并以抗ACE活性跟踪为前提，对透析截留后的袋内大分子部分进行活性跟踪分离纯化和结构分析，为阐明瓜蒌皮注射液的化學物质基础提供依据。endprint

1材料

11样品、对照品及试剂

瓜蒌皮20 kg购自上海康桥中药饮片有限公司（产地山东，批号150825；生产日期为2015年8月25日），DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂和Superdex系列分子筛凝胶柱购自通用电气GE Healthcare；普鲁兰多糖P82标准品套装：P5，P10，P20，P50，P100，P200，P400，P800，Shodex；水为超纯水（实验室自制）；血管紧张素转化酶ACE、HipHisLeu、卡托普利、4甲基吗啉硼烷、单糖标准品（D葡萄糖、D阿拉伯糖、L岩藻糖、L鼠李糖、D甘露糖、D木糖、D半乳糖）和三氟乙酸购自SIGMA公司，硼酸、硼砂、盐酸、喹啉、苯磺酰氯、无水乙醇和氯化钠均购自国药集团上海试剂有限公司；其他的试剂均为分析纯。

12仪器

安捷伦1260系列高效液相色谱仪（包括自动进样器、输液泵、脱气机、DAD 检测器、IR检测器及安捷伦Cirrus GPC软件）；安捷伦7890B型气相色谱仪配备7693型三重四级杆质谱仪，Rxi1ms毛细管柱（025 mm × 30 m，025 μm）购自Restek公司；利穗科技多糖分离系统配置Shodex示差折光IR检测器；电子天平（赛托利斯SECURA225D）；离心机（SIGMA3K15）；旋转蒸发仪（BUCHIRotavapor R300）；冷冻干燥机（LABCONCO45L）；纯水仪（密理博REFRENCE）。

2方法

21瓜蒌皮低聚糖的提取及分离纯化瓜蒌皮的提取

按照国家药品标准[WS11417（ZD1417） 20022008]的制备流程，即取瓜蒌皮5 000 g，加水40 L煎煮3次，第1次2 h，第2，3次各1 h，分次滤过，合并滤液并减压浓缩至相对密度为110～125（30 ℃），加入90%乙醇使含醇量为70%，静置72 h，取上清液，滤过，回收乙醇，真空干燥后得浸膏。浸膏经截留相对分子质量为1 000 的透析袋透析后收集袋内大分子部分，冷冻干燥后样品记做GLP（3186 g，得率637%）。GLP（50 g）经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂通过水，01，02，05，10 mol·L-1NaCl洗脱，苯酚硫酸跟踪，分别对应得到洗脱组分GLPW，GLP1，GLP2，GLP5，GLP10洗脱部位；活性最强洗脱组分GLP1（1183 mg，得率237%）以02 mol·L-1NaCl溶液为流动相经Superdex 75分子筛凝胶柱色谱，得 GLP11（215 mg，得率182%）。

22低聚糖纯度和相对分子质量测定

采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）法测定低聚糖的纯度及相对分子质量[14]。称取样品配置成质量浓度为2 g·L-1的溶液，对照品为不同系列普鲁兰多糖，配制成质量浓度为2 g·L-1的混合对照品溶液。色谱柱UltrahydrogelTM 1000（78 mm×300 mm）串联UltrahydrogelTM 250（78 mm×300 mm），Waters；流动相02 mol·L-1 NaCl溶液；流速08 mL·min-1；柱温40 ℃。分别精密吸取对照品与样品溶液各10 μL，注入HPGPC进行检测，图谱通过安捷伦Cirrus GPC软件数据处理。

23单糖组成分析

还原水解法进行糖组成分析[15]，取样品约1～2 mg，置15 mm×150 mm试管中，加200 μL 3 mol·L-1三氟乙酸溶液和50 μL 4甲基吗啉硼烷溶液，80 ℃油浴水解5 min，取出加入50 μL 4甲基吗啉硼烷溶液，120 ℃油浴水解1 h，取出。再加入100 μL 4甲基吗啉硼烷溶液，转入25 mL梨形烧瓶，60 ℃水浴减压蒸干，再加2～3 mL乙腈蒸干3次，然后加200 μL三氟乙酸和200 μL乙酸酐，50 ℃水浴乙酰化10 min，加3 mL水终止反应，室温放置30 min，用5 mL氯仿萃取全乙酰化衍生物，氯仿层用水洗3次，无水硫酸钠干燥，然后用氯仿稀释至50 mL溶液。GCMS检测，程序升温条件：140～198 ℃ （2 ℃·min-1），保持4 min，继续升温到217 ℃（1 ℃·min-1），保持4 min，最后升温到250 ℃（3 ℃·min-1），保持5 min；进样口温度为250 ℃；载气为氦气（体积流量1 mL·min-1），进样量为1 μL。

24血管紧张素转化酶抑制活性筛选

241马尿酸标准曲线的绘制[16]称取马尿酸溶于01 mo1·L-1硼酸盐缓冲液（pH 83，含03 mo1·L-1 NaCl）配制成04 g·L-1标准应用液。分别取005，010，015，020，025，030，040 mL标准液于10 mL带塞玻璃试管中，用蒸馏水稀释至05 mL，另取一支试管只加05 mL蒸馏水作空白。在避光条件下向每只试管加入06 mL喹啉，旋涡器上混合10 s后加入02 mL苯磺酰氯（BSC）（喹啉BSC 32比例最佳），立即盖紧管塞在旋涡混合器上混合20 s，反应液在30 ℃恒温水浴锅中避光放置30 min。随后向各管加入37 mL无水乙醇，混匀，继续避光放置30 min。取02 mL反应混合物加入到96孔平底培养板中，用酶标仪在波长492 nm下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，马尿酸含量为横坐标，绘制标准曲线。每个测定值均作3次重复。

242ACE抑制剂活性的测定[1617]样品组（a）：将ACE底物HipHisLeu溶于01 mol·L-1的含03 mol·L-1 NaCl的硼酸盐缓冲液中（pH 83），配制成5 mmol·L-1的溶液。取50 μL 5 mmol·L-1 HipHisLeu溶液与20 μL ACE抑制剂（即洗脱组分GLPW，GLP1，GLP2，GLP5，GLP10，GLP11或卡托普利）混合，在37 ℃恒温水浴中预热5 min。随后加入10 μL 01 U·mL-1 ACE溶液[用01 mol·L-1的含03 mol·L-1 NaCl的硼酸盐缓冲液中（pH 83）配制]，37 ℃反应30 min加入100 μL 1 mol·L-1 HCl溶液终止反应，并加入硼酸盐缓冲液至05 mL。然后ACE水解HipHisLeu生成的马尿酸量按241项马尿酸标准曲线的繪制方法进行测定。endprint

对照组（b）：将ACE底物HipHisLeu溶于01 mol·L-1的含03 mol·L-1 NaCl的硼酸盐缓冲液中（pH 83），配制成5 mmol·L-1的浓度。取50 μL 5 mmo1·L-1 HipHisLeu溶液与20 μL 01 mol·L-1硼酸盐缓冲液混合，在37 ℃恒温水浴中预热5 min。随后加入10 μL 01 U·mL-1 ACE溶液[用01 mol·L-1的含03 mol·L-1 NaCl的硼酸盐缓冲液中（pH 83）配制]，37 ℃反应30 min加入100 μL 1 mol·L-1 HCl溶液终止反应，然后加入20μL ACE抑制剂（即洗脱组分GLPW，GLP1，GLP2，GLP5，GLP10，GLP11或卡托普利），并加入硼酸盐缓冲液至05 mL。然后ACE水解HipHisLeu生成的马尿酸量按241项马尿酸标准曲线的绘制方法进行测定。

空白组（c）：取10 μL 01 U·mL-1 ACE[用01 mol·L-1的含03 mol·L-1 NaCl的硼酸盐缓冲液中（pH 83）配制]，加入100 μL 1 mol·L-1 HCl溶液，加入ACE底物HipHisLeu[用01 mol·L-1的含03 mol·L-1 NaCl的硼酸盐缓冲液中（pH 83）配制成5 mmol·L-1的浓度]，然后加入20 μL ACE抑制劑（即洗脱组分GLPW，GLP1，GLP2，GLP5，GLP10，GLP11或卡托普利），在37 ℃恒温水浴中加热35 min。随后加入硼酸盐缓冲液至05 mL。然后ACE水解HipHisLeu生成的马尿酸量按241项马尿酸标准曲线的绘制方法进行测定。

所有测定均作3次重复，取平均值，计算ACE的抑制程度。ACE抑制率=（Ab-Aa）/（Ab-Ac）×100%，其中，Aa为 ACE及ACE抑制剂都存在的条件下的吸光度，Ab为ACE抑制剂不参与反应的条件下测得的吸光度，Ac为ACE不参与反应的条件下的吸光度。

配制不同浓度的GLP11（200，100，50，25，125，625，3125 mg·L-1），按以上步骤测定其ACE抑制活性，以ACE抑制活性为纵坐标，log （GLP11浓度）为横坐标绘制曲线，并进行回归分析得出回归方程用于计算GLP11的半抑制浓度（IC50）。

25统计学分析

实验数据采用±s表示，数据分析采用GraphPad Prism软件进行Oneway ANOVA分析。

3结果

31GLP11的分离纯化

瓜蒌皮样品GLP经DEAE Sepharose Fast Flow分别以蒸馏水，01，02，05，10 mol·L-1 NaCl洗脱分离后，被依次分为5个部分GLPW，GLP1，GLP2，GLP5和GLP10；活性最强的部位GLP1再经Superdex 75凝胶柱进一步纯化，收集130～170 min流分，经浓缩、脱盐和冷冻干燥后得 GLP11，苯酚硫酸法检测GLP11显色明显，表明GLP11为糖类成分。

32纯度和相对分子质量测定

GLP11的纯度和相对分子质量采用高效液相凝胶渗透色谱法（HPGPC）进行测定，结果显示GLP11的HPGPC谱图呈单一峰，见图1，表明GLP11为均一低聚糖/多糖。以不同相对分子质量的普鲁兰多糖为对照品，经Cirrus GPC软件分析测得GLP11相对平均相对分子质量为1 367，为低聚糖。

33单糖组成分析

采用还原水解法对单糖糖组成进行分析，结果表明GLP11主要含阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖，3种单糖的摩尔比为02∶43∶100，见图2。

34血管紧张素转化酶抑制活性测定

实验结果显示GLPW，GLP1和GLP2在200 mg·L-1时均表现出较好的血管紧张素转化酶（ACE）抑制作用，其中GLP1的活性最强，抑制率为（5812±497）%。GLP1经Superdex 75凝胶纯化后的均一低聚糖GLP11经活性检测后，200 mg·L-1时ACE抑制率为（6909±391）%，IC50为（1134±86） mg·L-1，见图3。

4讨论

瓜蒌皮注射液主要选取水提醇沉上清液，根据文献报道和猜想：上清液中可能含极性较大的小分子成分、低聚糖和低相对分子质量的多糖成分[1819]，而大相对分子质量的多糖成分主要集中在沉淀部分[20]。大分子成分HPGPC检测通常采用2根凝胶色谱柱串联使用以提高分离效率，大孔径色谱柱连接在前进行初步分离，小孔径色谱柱连接在后进行精细分离，如本实验采用UltrahydrogelTM 1000（78 mm×300 mm）串联UltrahydrogelTM 250（78 mm×300 mm）检测GLP11的均一性和相对平均相对分子质量。目前前期已对瓜蒌皮注射液中小分子成分进行了系统的UPLC/ESIQTOFMS分析，共鉴定了19个成分，主要为极性较大的小分子，包含氨基酸、核苷酸、黄酮、多肽和唾液酸等，但未检测到有ACE抑制活性。由于瓜蒌皮注射液样品量的限制，本文并未直接用瓜蒌皮注射液进行分离纯化，而是按照国家药品标准（WS11417（ZD1417）20022008）瓜蒌皮注射液的制备流程进行制备，并采用活性跟踪方法筛选抗ACE成分，本文成功从瓜蒌皮中分离得到一种具有较强ACE抑制作用的均一低聚糖GLP11，相对分子质量为1 367，主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，3种单糖的摩尔比为02∶43∶100，其ACE抑制活性IC50为（1134±86） mg·L-1，本发现为瓜蒌皮注射液抗心血管的化学物质基础提供依据。

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[责任编辑孔晶晶]endprint