基于UPLC-Q-Orbitrap-MS技术的九里香根化学成分分析

孙璐,邓仕任,夏林波,边星,杨浩

(辽宁中医药大学药学院,辽宁 大连 116600)

九里香(MurrayaexoticaL.)为芸香科九里香属植物,广泛分布于印尼、东南亚及中国南方各省。作为《中国药典》2020年版九里香药材的基源植物之一[1],九里香被广泛应用于治疗牙痛、湿疹、风湿性关节炎等症[2]。目前对于九里香的化学成分研究大多集中于其枝、叶等部位,成分种类以香豆素和黄酮类为主[3-5],而对于其根部的化学成分则报道较少,尚未见对其根部化学成分的系统性研究。药理研究表明,九里香根浸提物具有广泛的药理活性,如抗氧化、抗菌、抗肿瘤、抗真菌和抗炎等[6],因此有必要对九里香根的化学成分开展系统性研究,以明确其药理活性物质。超高效液相串联四极杆静电场轨道阱质谱技术(UPLC-Q-Orbitrap-MS)具有高分辨率、高扫描速率、精确的结构表征等优势,可实现多种成分同时快速地鉴定和指认,已被广泛应用于中药化学成分的快速筛查和定性分析[7-9]。本研究旨在采用UPLC-Q-Orbitrap-MS技术对九里香根提取物的化学成分进行全面深入的分析,阐明其化学成分组,以期揭示九里香根的药效物质基础,为九里香药材资源的开发利用和临床用药提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器Q Exactive Plus四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific 公司);Ultimate 3000 超高效液相色谱系统(美国Dionex 公司);数据处理系统为Xcalibur 4.1工作站(美国Thermo Fisher Scientific 公司);ME204E十万分之一天平(梅特勒-托利多公司);KQ-3000E 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Direct-Q5型超纯水机(美国Millipore公司)。

1.2 试药川陈皮素、木犀草素、阿魏酸、腺苷和补骨脂素等对照品均购自四川维克奇生物科技有限公司,纯度均大于98.5%。九里香根收集自广东吉农种植基地,经辽宁中医药大学张建奎教授鉴定为芸香科植物九里香(MurrayaexoticaL.)的干燥根,标本存放于辽宁中医药大学药学院。水为超纯水,甲醇和乙腈为色谱纯,甲酸为质谱纯(美国Tedia公司),其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);以含0.1%甲酸的水溶液为流动相A,0.1%甲酸的乙腈溶液为流动相B。梯度洗脱条件：0～1 min,1% B;1～20 min,1% B→99% B;20～22 min,99% B。柱温：40 ℃,流速：0.2 mL·min-1,进样量：3 μL。

2.2 质谱条件电喷雾离子源,正、负离子扫描模式,电离源电压3 KV;毛细管温度320 ℃;透镜电压100 V;鞘气和辅助气为高纯氮气(纯度>99.99%),鞘气流速40 arb,辅助气流速10 arb;MS1为全扫描模式,扫描范围：50～1 250 m/z,分辨率：60 000;MS2采用数据依赖性扫描(DDA),选择MS1中最强10个离子进行扫描;裂解方式：CID;裂解能量：35 eV。

2.3 供试品溶液的制备九里香根干燥后粉碎,过三号筛,称取1.00 g粉末,置5 mL 80%甲醇中室温浸泡1 h,再超声提取(功率 250 W,频率40 kHz)1 h。提取液4 000 r·min-1离心10 min,取上清液过0.22 μm微孔滤膜,即得。

2.4 混合对照品溶液的制备精密称取上述对照品适量,分别加80%甲醇溶解,得对照品母液。分别吸取各对照品母液0.5 mL于10 mL容量瓶中,加80%甲醇溶液定容,经0.22 μm微孔滤膜过滤,即得。

3 结果

3.1 化合物鉴定采用UPLC-Q-Orbitrap-MS在“2.1”和“2.2”检测条件下对供试品溶液进行分析,得正、负离子模式下的基峰图(见图1),通过Xcalibur软件得到九里香根中各化学成分的保留时间及一级、二级质谱信息,通过与相关文献、质谱数据库和对照品进行对比,最终鉴定出63个化合物,包括香豆素类20个、有机酸类7个、生物碱类6个、黄酮类7个、氨基酸类6个、酰胺类4个、核苷类4个、磷脂类3个、其他类6个,具体结果见表1。

表1 九里香根的UPLC-Q-Orbitrap-MS化学成分分析

图1 九里香根的BPC图(A为正离子模式,B为负离子模式)

其中,精氨酸、谷氨酰胺、L-天门冬酰胺、帕拉金糖、蔗糖、尿苷、腺苷、鸟苷、黄嘌呤、酒石酸、新绿原酸、茵芋苷、L-色氨酸、对香豆酰基奎宁酸、5-O-阿魏酰奎宁酸、3-O-阿魏酰奎宁酸、7-甲氧基香豆素、N-乙酰-L-苯丙氨酸、N-乙酰色氨酸、N-反式阿魏酰酪胺、Muralatin J、LPE16∶0、LPE18∶1、芥酸酰胺、1-linoleoyl-GPI(18∶2)、15-keto-PGF1α等26种化合物为首次从九里香中鉴定得到。

3.2 九里香根中主要化学成分的质谱裂解规律及鉴定过程

3.2.1 有机酸类化合物从九里香根提取物中共鉴定出7个有机酸成分,其中酒石酸、新绿原酸、对香豆酰基奎宁酸、5-O-阿魏酰奎宁酸、3-O-阿魏酰奎宁酸为首次从九里香中鉴别得到。其中酰化有机酸类成分居多,此类成分的主要裂解过程为母离子脱去阿魏酰基(feruloyl,176)、奎宁酸(quinic acid,174)等基团产生碎片离子。以化合物22为例,负离子模式下的准分子离子峰的精确质量数为367.102 4,推断其分子式为C17H20O9,二级碎片离子主要为193.050 1,191.056 0,推测质谱裂解规律为准分子离子峰丢失一分子奎宁酸(quinic acid,174)和一分子阿魏酰基(feruloyl,176)形成碎片离子。结合MassBank数据库信息以及碎片离子的相对丰度,推测化合物22为5-O-阿魏酰奎宁酸,其二级质谱和可能裂解过程见图2。

图2 化合物22的二级质谱(A)和可能的裂解过程(B)

3.2.2 香豆素类化合物从九里香根提取物中共鉴定出20个香豆素类成分,其中,茵芋苷、7-Methoxycoumarin、Muralatin J为首次从九里香中鉴别得到。下面以化合物50为例介绍鉴定过程。该化合物的[M+H]+为305.102 0,推断分子式为C16H16O6。二级碎片离子主要为233.044 6、207.065 3,推测质谱裂解规律为准分子离子峰丢失一分子C4H8O,形成m/z 233.044 6的碎片离子,之后丢失一个C=O,形成m/z 207.065 3的碎片离子。结合相关文献记载[16],推测化合物50为Muralatin J,其二级质谱和可能裂解过程见图3。

图3 化合物50的二级质谱(A)和可能的裂解过程(B)

3.2.3 生物碱类化合物从九里香根提取物中共鉴定出6种生物碱,为九里香根茎部位的特征成分,以化合物62为例介绍其鉴定过程。一级质谱中,该化合物的[M+H]+为367.217 4,推断分子式为C26H26N2。二级质谱中,碎片离子m/z 250.159 0为母离子(m/z 367.216 9)丢失一分子吲哚(C8H7N)形成;m/z 245.107 3为母离子中的五元环裂解所得的碎片峰,该碎片峰进一步裂解可得到甲基吲哚的碎片离子(m/z 130.065 7);该母离子还可通过丢失一分子甲基吲哚(C9H7N)形成m/z 238.159 0,该碎片离子可进一步通过RDA裂解得到m/z 184.112 6。结合相关文献,推测化合物62为月橘烯碱(yuehchukene),一种双吲哚生物碱,其可能裂解过程见图4。

图4 化合物62的二级质谱(A)和可能的裂解过程(B)

4 讨论

本研究采用UPLC-Q-Orbitrap-MS技术对九里香根的化学成分进行了快速分析和鉴别。通过静电场轨道阱高分辨质谱提供的精确分子质量信息以及数据依赖性(DDA)模式所获得的二级质谱碎片信息,共从九里香根中初步鉴定出63种化学成分,主要包括香豆素类、黄酮类、酚酸类、生物碱类等,其中新绿原酸、茵芋苷、5-O-阿魏酰奎宁酸、Muralatin J等26种成分在该植物中首次被发现。本文以5-O-阿魏酰奎宁酸、Muralatin J等新发现的化合物为例,详细描述了化合物的质谱鉴定过程。在生物碱类成分的鉴定中,我们首次解析了九里香中的特征双吲哚生物碱-月橘烯碱的质谱裂解规律。上述结果表明,UPLC-Q-Orbitrap-MS技术具有快速灵敏、准确度高、简便高效的特点,尤其适用于中药等复杂体系中的化学成分分析,可望为九里香的药效物质基础研究提供依据。

在本试验的化合物鉴定过程中,我们也看到仍有一些成分在本试验的分析条件下无法给出明确的鉴定结果,如顺式-去氢蛇床子素和反式-去氢蛇床子素,二者互为同分异构体且具有几乎相同的二级质谱图,因此无法区分。后续可尝试借助轨道阱多级质谱或离子淌度质谱予以进一步鉴定。