鱼鳞膏调节IL-6/STAT3信号通路对难愈性皮肤溃疡模型大鼠创面愈合的影响

王晋军,王品一,黄贤明,张中旺,陈啸,李强

(青岛大学附属青岛市海慈医院,山东 青岛 266033)

体表慢性难愈合创面是临床的常见病、多发病,多由糖尿病、意外创伤、烧伤、痈疽破溃等疾病引起,因其反复发作、长期不愈,易形成顽固性及难愈性溃疡,属于临床难治性疾病之一[1-2]。近年来对难愈性溃疡治疗多采用抗生素和植皮疗法,但治疗效果并不理想,而且给患者带来沉重经济负担[3]。因此,研究难愈性溃疡创面愈合的发病机制,寻找有效的治疗方法具有重要意义。鱼鳞膏为本院制剂,由鱼鳞胶、麻油、凡士林等制备而成,具有清热祛腐、生肌长皮之功效,但目前对于其治疗难愈性溃疡的作用机制的研究相对匮乏。白细胞介素-6(interleukine-6,IL-6)/信号转导与转录激活因子3(signal transduction and transcriptional activator 3,STAT3)介导的炎症反应在皮肤溃疡愈合中发挥重要作用。研究表明,IL-6在糖尿病外周血和伤口组织中高表达,并可驱动STAT3激活,促进糖尿病伤口处的炎症反应,从而延缓伤口愈合[4]。但鱼鳞膏通过调节IL-6/STAT3信号通路对难愈性皮肤溃疡大鼠创面愈合的影响尚不清楚,因此,本研究构建糖尿病难愈性皮肤溃疡大鼠模型,旨在探讨鱼鳞膏对难愈性皮肤溃疡大鼠创面愈合的影响及潜在的作用机制,为临床治疗难愈性皮肤溃疡提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD大鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司,生产许可编号：SCXK(鲁) 2019-0003,8～10周龄,体重范围在250～320 g之间,适应性喂养一周,饲养温度22～25 ℃,湿度55%～60%,12 h光暗循环,不禁水食。实验动物使用许可证：SYXK(鲁) 20220014。

1.2 药品与试剂药膏制备：鱼鳞胶240 g、凡士林300 g、麻油2 000 g,将生石膏、炉甘石分别研成细粉,当归、土鳖虫、生地黄、龟板去净杂质,处理干净,饮片投料。将麻油加热至200 ℃左右炼油1 h分次加入龟板、当归、生地黄、土鳖虫至炸枯,药渣弃去,药油滤过。药油继续加热并分次加入生石膏、炉甘石加热10 min。将蜂蜡加热融化,滤过,与药油合并,冷却。待药油冷却至80 ℃时,加入鱼鳞胶搅拌成膏。

HE染色试剂盒(批号：G1120-100)、链脲佐菌素(STZ,批号：S8050)购自北京索莱宝科技有限公司;白细胞介素-6、-1β(IL-6、IL-1β,批号：E-EL-R0015c、E-EL-R0012c)、肿瘤坏死因子α(TNF-α,批号：E-EL-R2856c)ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司);重组大鼠IL-6蛋白(IL-6/STAT3通路激活剂,批号：SHR-388,南京赛泓瑞生物科技有限公司);兔抗血管内皮生长因子(VEGF,批号：ab32152)、转化生长因子-β1(TGF-β1,批号：ab215715)、IL-6(批号：ab259341)、STAT3(批号：ab68153)、p-STAT3(批号：ab30647)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,批号：ab208687)、血小板-内皮细胞黏附分子-1(CD31,批号：ab281583)、GAPDH(批号：ab9485)一抗抗体以及HRP标记的羊抗兔二抗(批号：ab6721)均购于美国Abcam公司;IL-6、STAT3(引物购于北京擎科生物科技股份有限公司);TRIZol 试剂(批号：15596018,Invitrogen公司)。

1.3 主要仪器设备Mx3000P实时荧光定量PCR仪(美国Stratagene公司);CX31光学显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模、分组和给药对照组用普通饲料喂养,建模组参考小剂量链脲佐菌素(STZ)联合高脂高糖饮食建立2型糖尿病大鼠模型的方法[5],高脂高糖喂养4周后,一次性腹腔注射STZ(35 mg·kg-1,0.3%),对照组注射等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(10 mL·kg-1)。注射后3、7、10 d取尾静脉血测量大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),连续3次测得FBG均≥16.7 mmol·L-1,则为糖尿病造模成功。造模成功后按照随机数字表法分为模型组、鱼鳞膏组、激活剂组,每组12只。普通饲料继续喂养28 d,腹腔注射戊巴比妥钠(3%,30 mg·kg-1)麻醉大鼠后,背部去毛,用蘸龙胆紫标记背部造模面积,无菌条件下剪去造模区皮肤,深达筋膜,无菌纱布包扎,鱼鳞膏组造模第2天开始给药(0.5 g·d-1),用医用纱布和橡皮膏固定,激活剂组大鼠用鱼鳞膏干预(0.5 g·d-1)+腹腔注射0.05 mg·kg-1IL-6/STAT3通路激活剂rIL-6[6],每天给药1次,连续给药21 d,对照组、模型组腹腔注射等量的生理盐水,伤口处用生理盐水干预后无菌纱布包扎。

1.4.2 测量大鼠创面愈合情况在建模及给药期间对大鼠创面边缘进行测量并拍照,采用Image Pro Plus 6.0图像分析系统对创面面积进行测定,并计算创面愈合率。创面愈合率=(给药前创面面积-给药后创面面积)/给药前创面面积×100%。

1.4.3 HE染色麻醉大鼠后,分离创面组织及创面周边肉芽组织,部分创面及创面周边肉芽组织经固定、脱水、包埋后切片及脱蜡和水化,随后进行HE染色,最后在显微镜下观察染色结果并拍照,录入MPIAS-400彩色病理图图文分析系统,观察新生毛细血管数。

1.4.4 大鼠创面组织中炎性因子的检测创面组织及创面周边肉芽组织经研磨充分后,离心取上清、严格根据ELISA试剂盒检测大鼠创面组织中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.4.5 免疫组化检测bFGF、CD31的表达创面组织切片经脱蜡和水化、过氧化氢处理后,滴加山羊血清封闭35 min,bFGF、CD31一抗(1∶1 000)在4 ℃孵育过夜,加入二抗(1∶2 000)在37 ℃孵育60 min、经DAB、苏木精染色,最后在光学显微镜下随机取6个视野观察,并使用Image-Pro Plus 6.0分析bFGF、CD31阳性细胞率。

1.4.6 qRT-PCR检测IL-6、STAT3 mRNA表达TRIZol试剂提取创面组织的总RNA、利用AMV逆转录酶合成cDNA,并以cDNA为模板配置qRT-PCR反应体系。IL-6上游引物：5′-CATCCAGTTGCCTTCTTG-3′和下游引物：5′-TATCCAGTTTGGTAGCATCC-3′;STAT3上游引物：5′-TGTTGGAGCAGCATTCTTC-3′和下游引物：5′-GGTCACAGACTGGTTGTTTC-3′;GAPDH上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′和下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′;IL-6、STAT3以GAPDH为内参,以2-ΔΔCT法计算各组组织中相对表达量。

1.4.7 Western blotting法检测大鼠创面组织中IL-6/STAT3通路蛋白表达提取创面组织总蛋白,对蛋白进行定量、电泳分离、转膜,最后再分别加VEGF(1∶2 000、TGF-β1(1∶2 000)、IL-6(1∶2 000)、STAT3(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)一抗4 ℃孵育过夜,加入二抗(1∶1 000)在37 ℃孵育90 min。Image J软件分析蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 鱼鳞膏对大鼠创面愈合的影响与对照组比较,模型组大鼠创面愈合率显著降低(P<0.05);与模型组比较,鱼鳞膏组大鼠创面愈合率升高(P<0.05);与鱼鳞膏组比较,激活剂组大鼠创面愈合率降低(P<0.05),结果见图1和表1。

表1 各组大鼠创面愈合率的比较

图1 第0、3、7和14天每组伤口表面愈合情况

2.2 鱼鳞膏对大鼠创面组织损伤的影响对照组大鼠创面上皮细胞排列有序、成纤维细胞和毛细血管数量较多;与对照组比较,模型组大鼠创面组织结构不完整,有大量炎症细胞浸润、成纤维细胞和毛细血管数量减少;与模型组比较,鱼鳞膏组大鼠创面组织结构稍显完整,炎症细胞浸润减少、成纤维细胞和毛细血管数量增加;与鱼鳞膏组比较,激活剂组大鼠创面组织结构损伤严重,炎症细胞浸润增加、成纤维细胞和毛细血管数量降低,结果见图2和表2。

表2 各组大鼠新生血管数的比较

图2 各组大鼠创面组织HE染色图(×100)

2.3 鱼鳞膏对大鼠创面组织中炎性因子水平的影响与对照组比较,模型组大鼠创面组织中IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05);与模型组比较,鱼鳞膏组大鼠创面组织中IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05);与鱼鳞膏组比较,激活剂组大鼠创面组织中IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05),结果见表3。

表3 各组大鼠创面组织中IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白水平比较

2.4 鱼鳞膏对大鼠创面组织中bFGF、CD31表达的影响与对照组比较,模型组大鼠创面组织中bFGF、CD31表达水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,鱼鳞膏组大鼠创面组织中bFGF、CD31表达水平升高(P<0.05);与鱼鳞膏组比较,激活剂组大鼠创面组织中bFGF、CD31表达水平降低(P<0.05),结果见图3和表4。

表4 各组大鼠创面组织中bFGF、CD31表达比较

图3 各组大鼠创面组织CD31、bFGF免疫组化染色

2.5 鱼鳞膏对大鼠创面组织中IL-6、STAT3 mRNA表达的影响与对照组比较,模型组大鼠创面组织中IL-6、STAT3 mRNA表达水平升高(P<0.05);与模型组比较,鱼鳞膏组大鼠创面组织中IL-6、STAT3 mRNA表达水平降低(P<0.05);与鱼鳞膏组比较,激活剂组大鼠创面组织中IL-6、STAT3 mRNA表达水平升高(P<0.05),结果见表5。

表5 各组大鼠创面组织中IL-6、STAT3 mRNA表达比较

A.对照组;B.模型组;C.鱼鳞膏组;D.激活剂组图4 Western blotting检测各组创面组织中VEGF、TGF-β1及IL-6/STAT3通路蛋白表达

2.6 鱼鳞膏对大鼠创面组织中VEGF、TGF-β1及IL-6/STAT3通路相关蛋白表达的影响与对照组比较,模型组大鼠创面组织中VEGF、TGF-β1蛋白表达水平降低,IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平升高(P<0.05);与模型组比较,鱼鳞膏组大鼠创面组织中VEGF、TGF-β1蛋白表达水平升高,IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平降低(P<0.05);与鱼鳞膏组比较,激活剂组大鼠创面组织中VEGF、TGF-β1蛋白表达水平降低,IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平升高(P<0.05),结果见图4和表6。

表6 各组大鼠创面组织中VEGF、TGF-β1及IL-6/STAT3通路蛋白表达比较

3 讨论

难愈性皮肤溃疡是一种病理反复性炎症反应,导致长期不愈,具有发病率高,病程长,预后较差的特点[7]。目前,难愈性皮肤溃疡创面愈合是临床创面修复的一大难题,如创面得不到及时清理和治疗,容易伴发感染,形成坏疽,导致截趾、截肢;若病情发展迅速,甚至会威胁生命[8-9]。

中医认为,难愈性皮肤溃疡归属于“席疮”“顽疮”“脱疽”等病证范畴,其中医致病机理为气阴虚引起血瘀,局部脉络失畅且伴湿热,进而导致血肉腐败,脏腑失调[10]。中医药治疗难愈性皮肤溃疡有着悠久的历史,而且疗效确切[11]。鱼鳞膏由鱼鳞胶、麻油、凡士林等制备而成,其中鱼鳞胶为主要成分,具有润肤止血、敛疮生肌之功效,为君药。鱼鳞胶性温,味咸,有祛瘀生新、敛疮生肌之功效。现代研究也表明,鱼鳞富含胶质蛋白,具有保护创面、止血、抗炎、镇痛的作用,能促进组织细胞生长[12-13]。血管生成在整个伤口修复过程中至关重要,血管提供祖细胞、氧气和营养物质,以维持伤口部位的增殖和重塑。bFGF、VEGF和TGF-β1被认为是皮肤伤口修复的重要生长因子。研究表明,bFGF可促进新的血管形成和创伤组织内的细胞增殖进而加速创伤的愈合[14]。CD31是一种内皮细胞标志物,可以反映血管生成程度[15]。在组织修复过程中,VEGF被认为是血管生成的重要调节因子,已被证明可促进血管内皮细胞的增殖、分化和血管生成、诱导肉芽组织的形成,从而促进伤口修复[16]。TGF-β1参与成纤维细胞增殖,胶原蛋白合成和细胞外基质重塑、血管生成和伤口愈合等多种生物学过程[17]。本研究发现,鱼鳞膏可促进创面组织中bFGF、CD31、VEGF、TGF-β1蛋白表达,促进新生毛细血管形成、减少炎性浸润、有效促进创面愈合。提示鱼鳞膏可作为难愈性皮肤溃疡的潜在治疗药物。

现代研究表明皮肤溃疡愈合是一个动态的过程,可分为连续而又相互重叠的3个阶段：炎症反应期、肉芽组织形成期(包括血管生成和上皮化)及基质形成和重塑期[18]。炎症反应期是创面愈合的第一个阶段,也是十分重要的阶段。过度和持续的炎症会产生不利于伤口愈合的环境,伤口愈合缓慢或无法愈合的风险更大。已发现难愈性皮肤溃疡患者血液中IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子显著水平升高[19]。IL-6是一种多效性细胞因子,在免疫、组织再生和炎症反应中发挥重要作用,从局部病变向全身发送炎症信号,它刺激免疫细胞募集单核/巨噬细胞,反过来,这些免疫细胞产生更多的炎症因子来募集更多的巨噬细胞,驱动炎症级联反应,引起持续的组织损伤,STAT3可以介导响应IL-6细胞因子家族的基因转录[20]。STAT3参与调节细胞分化、凋亡及血管生成。研究发现,抑制IL-6/STAT3信号通路,可减少IL-6/STING通路引起的持续炎症,并改善糖尿病伤口修复,是糖尿病组织损伤的可行治疗策略[4]。本研究还发现,鱼鳞膏可降低大鼠创面组织中IL-6、IL-1β、TNF-α炎性因子的水平、IL-6、STAT3 mRNA及蛋白表达水平。而使用IL-6/STAT3通路激活剂后,IL-6、IL-1β、TNF-α炎性因子水平明显升高,而血管生成和创面愈合相关蛋白bFGF、CD31、VEGF、TGF-β1表达水平则明显降低。提示鱼鳞膏可能通过抑制IL-6/STAT3信号通路,抑制炎症反应,促进难愈性皮肤溃疡大鼠血管形成及创面愈合。

综上所述,鱼鳞膏具有抑制炎症反应,促进难愈性皮肤溃疡大鼠血管形成及创面愈合的作用,其作用机制可能与抑制IL-6/STAT3信号通路有关。本研究为难愈性皮肤溃疡的临床治疗提供了实验依据。但鱼鳞膏促进难愈性皮肤溃疡创面愈合其他分子机制及通路仍需进一步的研究。