基于蜂花粉质量控制现状的问题分析及研究展望

朱娟娟,卢琪,曲珍妮,吕畅,周巧,石典花,戴衍朋

(山东省中医药研究院,国家中医药管理局中药蜜制和制炭炮制技术与原理重点研究室,山东 济南 250014)

蜂花粉为蜜蜂科动物意大利蜜蜂(ApismelliferaLinnaeus)或中华蜜蜂(ApisceranaFabricius)采集的显花植物雄蕊或裸子植物孢子囊内花粉细胞,加入采集的花蜜和自身分泌物形成的花粉团。蜂花粉是含有多种生物活性物质的天然营养源,主要有蛋白质、氨基酸、多糖、维生素、不饱和脂肪酸、多酚类和黄酮类等活性物质[1-2],还含有磷脂和生长激素[3],能促进儿童生长发育,同时还能增强遗传物质和蛋白质的合成,参与糖和脂肪代谢、调节。具有提高免疫力、增强体质、清除自由基[4-5]、抗肿瘤[6-8]、抗衰老[9]和治疗便秘等多种功效,被誉为“人类天然食品中的瑰宝”。

中医药是我国的瑰宝,千百年来在保障中华民族的繁衍昌盛方面发挥着极为重要的作用。2019年底至今,在治疗和预防新型冠状病毒感染工作中,中医药发挥了显著作用,进一步证实中医药在治疗和预防疾病方面具有独特的优势。但中医药的现状和发展依然存在一些问题,较为突出的是中药材及饮片的质量一致性问题,因此完善和提升中药材或饮片质量控制标准是加快促进中医药的高质量发展最为有效和关键手段。药食两用的蜂花粉富含大量对人体有益的活性成分,在保健和预防治疗方面应用均较为广泛,需求量巨大,由此如何确保蜂花粉质量安全,保障其有效性是急需解决的问题。通过查阅国内外近年来有关文献,本文从质量控制方面对蜂花粉的研究进展进行概述,以期为建立健全蜂花粉的产品标准体系及其质量安全评价体系提供参考。

1 现行标准收载情况及存在的问题

1.1 现行标准及收载情况蜂花粉在历版《中国药典》中均未被收录;全国仅有6省现有中药材标准中收载了蜂花粉药材,详情见表1。

表1 蜂花粉各地中药材标准收载情况

1.2 现有质量标准存在的问题

1.2.1 命名与来源不一一方面,蜜蜂采集花粉时,植物的孢粉源不同,蜂花粉的种类也不相同。现有药材标准中贵州省、山东省、吉林省药材标准中收录为蜂花粉药材,《甘肃省中药材标准》收录油菜蜂花粉,《浙江省中药材标准》收录茶花粉和油菜花粉,《福建省中药材标准》收录玉米花粉和油菜花粉。现有蜂花粉药材标准中命名不统一,不规范的中药名称可能导致中药饮片处方调剂混乱,成为危及药品质量及医疗安全的隐患。另一方面,现有标准从来源上大部分限制了蜂花粉的种类,蜂花粉资源优势还远远未体现出来,严重制约了行业的发展。

1.2.2 检验项差异较大6省中药材标准中《山东省中药材标准》含量测定项为含氮量,专属性成分鉴别空缺,设定的标准薄弱。检查项下福建省中药材标准中收载的玉米花粉和油菜花粉中规定了杂质限量,分别为15%和2%,差异较大,其他省药材标准中未收录杂质检查项。

鉴别项下,山东省和福建省只有显微鉴别一项,其他省份增加了显色或薄层鉴别项,其中吉林省和浙江省药材标准中为显色反应,专属性差。《甘肃省中藏药材标准》(2020年版)中增加了以对照药材为对照的薄层色谱鉴别,仅《贵州省中药材民族药材质量标准》(2019年版)中为以山柰素为对照品的薄层鉴别专属性更强。

含量测定方面,2017年版《浙江省中药材标准》以紫外分光光度法测得油菜花粉总黄酮含量,规定其总量以无水芦丁计不得少于3.0%。山东省、贵州省、吉林省、浙江省和福建省中药材标准中仅规定了含氮量,以总黄酮和含氮量作为含量测定指标缺乏专属性。《甘肃省中药材标准》(2020年版)中收录的油菜蜂花粉中增加了以槲皮素和山柰素为对照的含量测定项,专属性强且解决了化学成分含量标准的空缺,但标准中仅收载油菜蜂花粉,蜂花粉质量标准的制定未充分考虑到蜂花粉的多来源性和不同来源蜂花粉存在的化学成分差异问题。

1.2.3 用法、用量不统一山东省、吉林省、贵州省、浙江省、福建省的药材标准中仅规定用量和服用次数。《甘肃省中药材标准》(2020年版)中规定用法用量为：取经破壁的花粉适量,冲服或入制剂。现行药材标准中蜂花粉的用法用量差异大,不规范,轻者影响患者的治疗效果,甚至导致用药安全问题的发生。

2 蜂花粉质量控制研究进展

2.1 影响蜂花粉质量的因素

2.1.1 产地、来源差异不同产地和来源蜂花粉中蛋白质和矿物质含量差异较大[10-11]。不同来源蜂花粉中总黄酮含量和自由基清除力差异亦较大,其中油菜蜂花粉中总黄酮含量最高,具有较强的自由基清除和抗氧化能力[12]。任乃艳[11]对15种蜂花粉的总黄酮含量进行分析发现五味子蜂花粉黄酮含量最高,油菜花次之,是猕猴桃蜂花粉总黄酮含量的6.7倍。张红城等[13]对6种不同蜂花粉的多酚及黄酮提取物含量进行了对比,结果油菜蜂花粉的黄酮类化合物含量最高,是荷花蜂花粉黄酮类含量的近27倍。牛德芳等[14]测定了市面上常见的7种蜂花粉的总黄酮含量,结果油菜蜂花粉的总黄酮含量显著高于其他蜂花粉。黄新球等[15]测定了5种蜂花粉的蛋白质、氨基酸和矿物质含量,结果均存在较大差异,从提供优质蛋白营养量来看,茶花蜂花粉优于油菜花蜂花粉等。

2.1.2 重金属有害元素残留重金属元素是一种可以通过一系列途径富集于植物体内,通过食物链危害人体健康的高毒性、持久性、难降解的环境污染物。有研究表明重金属的控制和管理是中药材急需解决的问题[16]。李硕等[17]对油菜花粉和茶花粉中7种重金属元素含量进行了考察,发现油菜花粉和茶花粉均存在重金属污染问题。魏月[18]发现与蜂蜜和蜂胶比较,蜂花粉与环境介质之间存在更多、更稳定的显著相关关系,更易受到环境中的重金属污染且逐渐累积。

2.1.3 抗生素、农药残留养蜂生产中,为了防病治病蜂农会使用或者在饲料中添加抗生素,容易造成蜂产品抗生素残留。花粉中农药的主要来源是花期前后喷洒农药和加工过程中混入农药,尤其是随着新药物的开发使用,蜂产品中药物残留的种类也随之增多,监测抗生素和农药残留成为蜂花粉质量控制中一个重要因素。蜂花粉中检出农药种类多,除了在蜂蜜中常检出的新烟碱类、有机磷类、拟除虫菊酯类外,还常能检出氨基甲酸酯类、大环内酯类和苯基吡唑及其代谢物等[19]。对国内市场上的蜂花粉农药残留检测发现,噻虫胺、吡虫啉、多菌灵、三唑醇、噻虫嗪、吡虫脒、嘧菌酯、蝇毒磷和毒死蜱等9种农药广泛分布于蜂花粉中[20]。有学者[21-22]运用气相色谱-质谱联用对蜂花粉中的有机氯农药残留进行检测,发现有一定的残留。宋梓豪[19]建立了蜂花粉中53种农药及5种代谢物的简单、快速、灵敏、稳定的检测方法,监测结果显示,在21个省区70种蜂花粉样品中28批次蜂花粉样品检出13种农药,检出率较高的为毒死蜱(18.6%)、啶虫脒(10.0%)、噻虫嗪(7.1%)。《中国药典》2020年版要求植物类药材全面禁用新增的33种农药,禁用农药推荐应用液相色谱串联质谱检测的有22种,推荐应用气相色谱串联质谱检测的有22种,其中11种化合物可同时用两种方法检测,最低定量限0.01 mg·kg-1。药食两用的蜂花粉在抗生素农药残留的风险评估及限量标准的研究工作应加快推进。

2.1.4 用法、用量蜂花粉细胞的外壁坚硬 (主要由孢粉素、蛋白质、纤维素、果胶质等组成),由于孢粉素是一种类似角质或木栓质的脂类物质,可耐酸、耐碱、耐温、耐压、耐生物分解等,进而影响其活性成分的溶出[23],在一定程度上限制了蜂花粉的开发利用。吴伟等[24]研究发现在未破壁的蜂花粉中几乎一半的营养素没有被消化吸收,直接排出体外。破壁蜂花粉经体内外消化后,其蛋白质和粗脂肪等主要营养素消化率可达85%,还原糖和氨基酸的释放速率提高了1.5～2倍。破壁更容易使营养物质充分释出有利于消化吸收。肖兴英等[25]对破壁前后油菜蜂花粉中黄酮含量进行测定,槲皮素-3-O-槐糖苷和山柰素-3-O-槐糖苷在含量上分别提高了73.5%和47.8%,破壁有利于黄酮类成分的释放。有学者[23,26]总结了目前蜂花粉破壁技术进展,发现不同来源的蜂花粉不仅在结构上存在较大差异,其破壁技术也不尽相同。蜂花粉的用法用量值得更深一步的探索。

2.2 蜂花粉检验项研究进展蜂花粉鉴别检查目前主要包括光谱和薄层鉴别,符致秋等[27]通过扫描电子显微镜和表面增强拉曼光谱建立了7种蜂花粉的快速鉴别方法。吴杰等[28]采用傅立叶变换红外光谱对6种不同蜂花粉进行快速无损鉴别,以上仅对蜂花粉的品种来源进行区分。王满生等[29]运用TLC-DPPH对油菜花粉粗黄酮提取物成分分析,可快捷、直观的筛选出蜂花粉中具有清除自由基或抗氧化活性的化合物,但在定性鉴别方面相对于传统的TLC鉴别方法不够简便直观。姚海清等[30]用普乐安片做对照药材建立蜂花粉的TLC鉴别方法。宁生荣[31]建立了以山柰素-3-O-β-D-(2-O-β-D-葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷(KMP)为对照的油菜蜂花粉TLC定性鉴别方法,提供了具有较强专属性的质量评价依据。

蜂花粉含量测定研究主要有蛋白质、黄酮和多糖3个方面。其中蛋白质测定方面,周望庭等[32]用凯氏定氮法测定了枸杞蜂花粉中蛋白质含量,并采用OPA柱前衍生法进行了游离氨基酸含量测定。牛德芳等[14]用凯氏定氮法测定了7种蜂花粉中蛋白质含量,并用自动氨基酸分析仪测定氨基酸的浓度。含氮量测定无法对其主要有效成分建立定性、定量检测方法,无法对其质量进行全面评价与控制。黄酮类化合物具有降血脂、抗动脉硬化、抗炎等多种生理活性,目前对蜂花粉中多酚和黄酮类化合物含量测定多采用紫外分光光度法[12,32-35],该方法无法对单一成分进行定量。姚海清等[30]采用HPLC测定油菜蜂花粉中槲皮素和山柰素的含量,作为油菜蜂花粉的质量控制标准。郑敏燕等[36]采用HPLC法测定油菜花粉中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量,结果分别为0.928%、0.295%和0.0834%。王满生等[29]采用HPLC法测定油菜蜂花粉中槲皮素和山柰素含量。槲皮素、山柰素结构骨架的黄酮苷及苷元普遍存在于不同植物来源的蜂花粉中,仅以蜂花粉中总黄酮和酸水解后的槲皮素、山柰素含量作为评价蜂花粉质量的标准缺乏专属性。有研究[37]建立了11批不同产地油菜花粉的指纹图谱,其相似度评价结果表明不同地区油菜蜂花粉中化学成分是相对稳定的,建立的指纹图谱可行,为其质量评价提供一定依据。蜂花粉富含多糖,主要包括果胶多糖、纤维素以及半纤维素等,蜂花粉多糖具有增强免疫、降糖降脂、抗衰老、抗癌等多重功效。目前对蜂花粉多糖的研究多集中在总多糖的提取、分离、含量测定[38-41],以及蜂花粉总多糖药理活性的研究。胡景华等[42]发现不同产地油菜花粉的多糖含量没有显著差异。涂宗财等[43]优化筛选出苯酚-硫酸法测定油菜花粉多糖的最佳显色条件,降低了多糖测定中其他成分的影响,使测定结果更加准确。

3 讨论与展望

3.1 规范蜂花粉质控标准中药存在成分较为复杂、基础研究相对薄弱、有效成分不明确及作用机制不清楚等问题,如何建立更有效的中药质量评价及质控体系仍是目前研究的热点和难点。蜂花粉即是典型代表,现有蜂花粉药材标准中命名与来源不统一,检验项差异大,没有以明确药效物质为指标建立定性、定量检测方法,未关注重金属及农药残留等质控指标,无法对其质量进行全面评价与控制,进行质量控制的检验项目应予以修订提高。用法、用量不统一,直接影响药物的疗效和患者的安全。基于此,笔者认为蜂花粉质量标准需要进一步修订和完善,以建立较为全面且符合蜂花粉特色的行之有效的质量标准。

3.2 加强蜂花粉的来源研究我国作为世界养蜂大国,显花植物种类繁多,花期漫长,花粉资源丰富,可作为商品性的蜂花粉来源有40余种,但商品化的蜂花粉仅10余种。绝大多数的蜂花粉尤其是我国五味子、益母草、红花等中草药花粉源的蜂花粉尚未得到有效开发利用。颜秋燕[44]研究发现党参蜂蜜和党参成分有相关性,党参蜂蜜具有不同于其他蜂蜜的特征成分,可为党参蜂蜜的品质和功效评价提供理论依据,且党参蜂蜜具有一定量的党参功能成分。蜂花粉为蜜蜂采集的显花植物雄蕊或裸子植物孢子囊内花粉细胞,加入采集的花蜜和自身分泌物形成的花粉团,那么蜂花粉中是否携带有对应中药特有有效成分而具有特殊药效,这需要进行更深一步的研究,如两者之间存在量值传递关系,中药花粉源的蜂花粉将能得到更广泛地应用。基于此,蜂花粉质量标准制定过程中,不仅应考虑到蜂花粉的多来源性,也应考虑到花粉源植物化学成分的特有性。

3.3 加强蜂花粉药效物质和作用机制研究随着蜂花粉的开发利用,越来越多的学者留意到蜂花粉的多来源性,但目前研究多集中在不同来源蜂花粉之间总黄酮、总多糖的含量差异和药效差异,极少有涉及不同来源蜂花粉之间化学成分差异,药效物质基础及作用机制未进行深入研究,导致蜂花粉药效物质基础仍不明确[7,45-46]。任顺成等[47]利用AB-8大孔吸附树脂对玉米花粉黄酮进行了精制,并通过高效液相和质谱分析得知精制的玉米花粉黄酮中至少含有槲皮素-3,3′-O-二葡萄糖苷等7个黄酮类化合物。虽然蜂花粉中具体药效物质基础未明确,但相关研究已证实蜂花粉中所含的橙皮素、槲皮素等化合物对小鼠具有保肝作用[48-49],槲皮素可阻断肿瘤细胞中特定基因的表达,山柰素可抑制PC-3癌细胞的生长[50]。笔者在对收集的13批蜂花粉进行山柰素含量测定的实验中发现,不同蜂花粉水解后山柰素的含量相差悬殊,油菜蜂花粉中山柰素含量最高0.22%,茶花蜂花粉0.04%,莲花蜂花粉因含量过低未测得含量。因此,这些已知药效的化学成分能否直接作为蜂花粉的质控指标还有待进一步考证。在对收集到的13批蜂花粉进行薄层鉴别时发现,3个来源蜂花粉中均有山柰素荧光斑点,此还有两个明显的共有斑点,因对照品限制目前还未明确这两个共有斑点的具体成分,后续可以明确两个共有斑点的化学成分,结合多批次多来源蜂花粉薄层鉴别实验改进薄层鉴别项,建立多元化质控标准。

综上所述,下一步应重点关注蜂花粉多来源性及有毒、有害物质安全性评价,针对不同来源蜂花粉应建立以药效明确的化学成分为对照和现代科技手段相结合的鉴别、检查和含量测定方法,规范其用法用量,完善蜂花粉质量标准及安全评价体系,尽快达到有效评价不同来源蜂花粉质量的目标。