巨噬细胞极化在糖尿病性创面愈合中的作用及药物研究进展

李杰辉,梁彬,王丽

(1.广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023;2.广西中医药大学,广西 南宁 530001;3.广西壮族自治区中医药研究院,广西 南宁 530022)

据2019年国际糖尿病联盟(IDF)的数据显示,全世界的成人糖尿病患者约有4.63亿,有约2.32亿的成人糖尿病未被诊断[1]。调查发现,我国50岁以上糖尿病患者 1 年内新发足溃疡的发生率为8.1%,治愈后的DFU患者1年内新发足溃疡的发生率为31.6%[2]。在糖尿病患者因机体长期处于高糖环境中,加之机体免疫力低下,因此会出现不同程度的神经、血管病变,下肢因缺血、创伤、感染等原因,导致溃疡形成和组织坏死,出现糖尿足[3]。全球糖尿病患者数量逐年增长,与其密切相关的慢性伤口的护理和治疗需求也日益增加,而伤口愈合延迟,这往往导致非创伤性肢体截肢,对患者的身心健康及生活质量有严重的影响,是临床亟待解决的难题。

创面愈合是一个良好协调的动态过程,经历了止血、炎症、增殖和重塑4个阶段[4],旨在恢复组织完整性。有不同的细胞(如：巨噬细胞)参与其中,愈合过程中受到严格的调控。而糖尿病创面愈合又涉及多种因素,如：糖代谢异常、细胞外基质表达降低、血管生成受阻等[5]。在急性创面愈合前期,被招募的巨噬细胞最初表现为促炎型,可清除病理碎片。随着创面愈合的过程变化,伤口组织中的巨噬细胞极化成抗炎型,以促进组织修复。在糖尿病创面组织中,促炎型巨噬细胞转换为抗炎型的过程受到机体高糖内环境的影响,导致了慢性炎症和延迟创面愈合[6]。糖尿病中这种分化巨噬细胞行为的病因目前尚不清楚,但可能是多因素的。

1 巨噬细胞概述

巨噬细胞广泛存在于人体组织中,是维持组织内环境稳态的主要功能细胞,可通过释放细胞因子来激活免疫反应,参与炎症调节、分泌抗炎因子和维持内环境稳态等多个生物学过程。根据刺激的不同,可活化为M1型,即经典活化巨噬细胞(classically activated macrophage)和M2型,即替代活化巨噬细胞(alternatively activated macrophage),而M2型巨噬细胞又可细分为M2a、M2b和M2c 3种亚型。在创面的修复过程中不同表型的巨噬细胞扮演着不同的角色。M1型巨噬细胞主要通过Th1信号通路诱导,涉及脂多糖(LPS)和IFN-γ等因子,并表达高水平的炎症因子。另一方面,M2型巨噬细胞通过Th2信号通路诱导,涉及IL-4、IL-13等因子,与抗炎反应相关[7]。

巨噬细胞群体中的异质性是由于它们对微环境信号的不同反应,被描述为“巨噬细胞极化”(MP)[8]。巨噬细胞的可塑性较高,在不同环境的刺激下,M1型巨噬细胞可转化为M2型巨噬细胞,通过分泌多种抑炎因子,促进胶原合成、血管生成和组织修复,抑制创面炎症反应[9],并且在创面愈合不同阶段M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的有序转化是创面如期愈合的关键,以其为靶点可为创面修复提供新方向。

2 巨噬细胞与糖尿病性创面的关系

在糖尿病患者中,高血糖诱导产生活性氧(ROS)和晚期糖基化终末产物(AGEs),会导致低级别炎症级联反应和组织损伤[10]。创面愈合的过程都是相互影响的,糖尿病性创面因高血糖引起的过度炎症和血管病变延长了炎症期,其中炎症期的延长会对随后皮肤的再生产生不利影响。然而延迟的伤口愈合会大大增加伤口感染的风险,这就需要在临床中进行清创,但会进一步破坏伤口周围的血管床,进而恶化愈合过程,导致恶性循环。Huang等[11]发现在高糖创面环境中M1巨噬细胞浸润增多,在微环境中产生过量的肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)。而TNF-α可上调角质形成细胞的基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)的表达,会影响角质形成细胞迁移,进而糖尿病患者伤口愈合延迟。糖尿病患者因高糖内环境这一因素的存在,巨噬细胞极化受到影响,糖尿病患者创面中极化过程出现障碍,M1型巨噬细胞持续存在未能及时转化成M2型,导致创面出现慢性炎症,患者创面愈合延迟。此外,何孙跃[12]通过制备AGEs干预Raw 264.7巨噬细胞,发现AGEs显著促进巨噬细胞促炎型细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达和分泌,并能够抑制M2极化相关标志物(Arg-1和KLF4)的表达。由此可见,AGEs可通过上调M1极化相关标志物的表达,抑制M2极化,致巨噬细胞M1/M2极化失衡。因此,糖尿病性创面难以愈合的机制与M1/M2巨噬细胞极化失衡密切相关。

3 巨噬细胞极化影响糖尿病创面愈合的可能机制

3.1 调节胰岛素抵抗胰岛素抵抗(insulin resistance,IR),是指因身体机能发生改变以致胰岛素不能发挥摄取葡萄糖的作用,导致机体对葡萄糖的利用率下降,机体为调节内环境血糖平衡而分泌过多胰岛素,导致形成高胰岛素血症,以维持血糖的稳定[13]。巨噬细胞在胰岛中的作用主要是促进炎性因子的释放和胰岛β细胞坏死,而在周围组织中巨噬细胞的分化活动障碍与糖脂代谢发生异常,均与脂肪细胞中胰岛素抵抗的发生密不可分[14]。有研究发现[15]脂肪组织中巨噬细胞浸润的增加与促炎因子IL-6水平的增加有关,而IL-6是与M1型巨噬细胞相关的细胞因子。因此通过促进巨噬细胞由M1型向M2型极化,可降低胰岛素抵抗水平。

牛瑞芳[16]运用自体富血小板凝胶联合负压引流治疗糖尿病足发现,观察组胰岛素抵抗(HOMA-IR)水平明显低于对照组,观察组创面愈合率达94.74%,明显高于对照组的74.29%,另外在比较创面愈合时间、住院天数上,观察组均优于对照组。说明该治疗可有效降低胰岛素抵抗水平,促进创面愈合。另外也有临床研究[17]证明胰岛素抵抗水平与糖尿病性创面愈合呈负相关。因此,可下调胰岛素抵抗水平,促进糖尿病性创面愈合。糖尿病的许多并发症与活化巨噬细胞紧密联系在一起,一方面,促炎因子的堆积抑制了胰岛素信号传导,直接引起了机体胰岛素抵抗的发生。另一方面,巨噬细胞的不同亚型存在明显的燃料偏好差异,经典活化M1型巨噬细胞优先代谢葡萄糖作为能量底物,而选择性激活M2巨噬细胞主要利用脂肪酸燃料进行细胞的行为活动[15]。有研究发现[18],miR-330-5p作为M2极化的调节因子,可能通过miR-330-5p/Tim-3轴增强巨噬细胞的M2极化而下调糖尿病患者的胰岛素抵抗。

3.2 调控炎症反应巨噬细胞是参与组织微环境炎症反应的主要功能细胞,具有参与炎性损伤、抗炎和组织修复等多重作用。有研究发现[19],M1型巨噬细胞通常在创伤初期聚集于患处,在电镜下观察可观测到中性粒细胞被巨噬细胞吞噬,表明此时的M1型巨噬细胞具有很强的促炎作用。但过多的M1型巨噬细胞募集于创面局部,又会对正常的机体造成损害,从而促进炎症恶化。M2型巨噬细胞在创伤修复阶段聚集在伤口部位,有利于炎症的消除和修复组织损伤,可通过调节性或抑制性效应抑制急性炎性反应以及慢性炎症反应[20]。

研究发现,多种信号通路通过调控巨噬细胞极化参与炎症反应进而促进糖尿病创面愈合。如：JAK/STAT信号通路可通过传导细胞因子刺激信号,参与调控多种细胞活动。STAT家族是在JAK/STAT通路中发挥重要作用的转录因子家族[21],过氧化物酶增殖物激活受体 γ(peroxisome proliferater-activated receptor-γ,PPAR- γ)是转录激活物,与M2巨噬细胞的激活密切相关。PPAR- γ作为M2基因型的增强子,通过其启动子STAT6将巨噬细胞分化成M2a细胞,促使巨噬细胞向M2分化[21]。另有研究发现,局部注射PPAR- γ激动剂可将巨噬细胞从促炎M1表型转变为正在愈合M2表型,从而控制炎症[22]。可通过调控该信号通路,有效的抑制巨噬细胞中炎症相关蛋白和促炎因子的表达,从而发挥抗炎作用。胰岛素通过上调PPAR-γ表达和诱导P38介导的PPAR-γ去磷酸化来发挥抗炎作用,从而下调炎症反应,并调节M1巨噬细胞对高糖的反应,从而改善慢性伤口愈合[23]。所以,在创面修复的过程中,可在适当的时间点使用药物干预JAK/STAT信号通路,通过调控巨噬细胞的迁移,防止炎性物质的异常聚集,有助于缩短糖尿病患者的炎症反应过程,消除导致伤口愈合受损的慢性炎症。

近年来,表观遗传机制在糖尿病及相关并发症的病理生理中发挥着重要作用[24]。糖尿病患者长期处于氧化应激和高糖状态的内环境中,导致体内微环境发生改变,进而使表观遗传密码发生变化,表现为炎症基因表达的改变,从而引发糖尿病并发症[25]。表观遗传学研究是指DNA序列不改变,通过DNA甲基化,组蛋白修饰以及非编码RNA,来调控基因表达发生变化的学科。这些变化主要影响与基因相关的启动子区域,从而导致或增加或抑制基因表达。这些修饰可由环境刺激触发,并最终导致不同蛋白质的表达改变[26]。目前巨噬细胞极化与非编码RNA的关系也是研究热点,尤其是micRNA参与调控炎症反应与巨噬细胞相关。关于micRNA在调控巨噬细胞可塑性和极化中的作用的研究越来越多,如miR-155过表达可诱导M1巨噬细胞极化和促炎细胞因子释放[27];而miR-146a在M2极化的条件下表达升高[28]。目前,一些实验揭示了不同表观遗传修饰与糖尿病并发症的相关性。随着生物医学工具的进步,检测生物标记物(如患者的预后和诊断工具)可能会成为替代方法。然而使用表观遗传修饰作为治疗靶点,需要在使用前进行广泛的临床前和临床评估。

3.3 促进血管修复巨噬细胞作为组织修复和再生参与者,在创面愈合过程中扮演重要角色。大量数据表明,巨噬细胞可分泌许多重要因子,包括细胞因子和生长因子,调节血管生成,也可作用于血细胞[29]。巨噬细胞感知血管损伤并在损伤部位聚集,促进血管新生,促进血流恢复。巨噬细胞在组织和血管修复中的功能包括分泌促炎细胞因子和趋化因子维持初始白细胞浸润,吞噬入侵的病原体和坏死的细胞碎片,释放基质金属蛋白酶(MMP)进行细胞外基质重塑等来促进血管生成[30]。

不同的巨噬细胞参与血管修复可能处于不同的阶段和不同的方面。一般来说,M1巨噬细胞在炎症期占主导地位,而M2巨噬细胞在愈合后期发挥促血管生成和促进创面愈合的作用。但关于M1 型巨噬细胞在血管生成中所发挥的作用有争议性。Hsieh等[31]治疗小鼠缺血性肌肉损伤时,采用通过外源注入M1型巨噬细胞的方法,发现M1型巨噬细胞在缺血性损伤前期可调节血管修复,促进骨骼肌再生。相反M1型巨噬细胞还可上调促炎miRNA的表达,如miR-155。在糖尿病伤口中MiR-155可导致中性粒细胞和巨噬细胞等炎症细胞的积累和活化增加[32]。M1型巨噬细胞产生血管内皮生长因子(VEGF)、FGF-2和IL-8,这些可促血管生成和促进细胞迁移,但也会产生一些高度促炎症因子。M2型巨噬细胞可稳定血管生成,促进成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积[33]。巨噬细胞在血管生成中的涉及调多种生物因子及维持机体内环境稳态的多因素协同过程。

4 药物调控巨噬细胞极化促进糖尿病创面愈合

近年来,多种药物通过多途径、多靶点调控巨噬细胞极化相关来治疗糖尿病性创面,其中中药通过调控巨噬细胞极化促进糖尿病创面修复的研究逐年增加,是中医外治干预巨噬细胞极化促进创面修复的研究热点之一[34]。在多项中药治疗糖尿病创面的实验中[35-40],发现多种中药单体或多糖类可下调M1型细胞表面标志物CD86、iNOS等表达,上调M2型细胞表面标志物CD206、Arg-1的表达,通过调控巨噬细胞向M2亚型极化,进而促进糖尿病创面愈合。其中白芷、芦荟多糖可下调IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的分泌;而黄芪多糖则与之相反,在炎症期可增加炎症因子的表达,维持创面炎症反应的正常进行;芍药苷、槲皮素可上调抑炎因子IL-10的表达,从而减轻糖尿病创面中炎症浸润,还可刺激血管内皮细胞的细胞活动,促进血管新生,加快糖尿病创面由炎症期向增殖期过渡。白芷、芦荟多糖等提高VEGF、TGF-β1等生长因子的分泌,进而改善血管生成和上皮再生、促进胶原沉积,从而达到改善糖尿病伤口愈合的作用。Li等[41]发现葛根素发现葛根素能够显著降低糖尿病创面组织中巨噬细胞和中性粒细胞的浸润,显著抑制NF-κB和MAPK信号通路,下调炎症细胞因子的表达,诱导巨噬细胞M2极化,促进糖尿病小鼠创面愈合。Chen等[42]研究表明大黄素处理db/db糖尿病小鼠伤口,能够抑制伤口组织p65-NF-κB复合物,显著增加M2极化巨噬细胞的比例和TGF-β的表达水平。陈佳等[43]发现回阳生肌汤可下调db/db小鼠创面中MCP-1表达,抑制促炎单核细胞 Ly6chi/+型的动员和募集;同时上调M-CSF表达,促进抗炎单核细胞Ly6clow/-型动员和募集,从而减少创面中M1型巨噬细胞,增加M2型巨噬细胞,使局部创面中M1型相关炎症因子水平下调,减轻创面炎症,从而促进创面逐渐愈合。传统的中药具有较低的生物利用度,水溶性差的特点,目前研究多采用水溶性的凝胶作为新的药物载体[42],一项含人脐带间充质干细胞的水凝胶治疗糖尿病创面研究中发现[43],该水凝胶对糖尿病创面修复的可能机制之一是通过调控巨噬细胞向M2表型极化以及促进抑炎因子IL-10的表达。以上各药物通过调控巨噬细胞极化促进糖尿病创面修复的相关机制汇总见表1。

表1 药物调控巨噬细胞极化促进糖尿病创面愈合的机制总结

5 小结

近年来关于研究巨噬细胞对糖尿病性创面愈合作用的机制已取得一定的进展,其中对巨噬细胞调控机制的研究包括表达遗传观和microRNA的基因调控、信号通路等,均证明巨噬细胞在促进糖尿病性创面修复的过程中扮演关键角色[45]。这两种分型的巨噬细胞看似对立的功能必须受到严密的调控,才能对外来分子或受损组织产生有效而恰当的反应。但在未来研究中仍面临很多挑战：①巨噬细胞极化的机制涉及的内容较多,其中与糖尿病创面的联系,仍需更多的研究;②多数的实验对象为动物或细胞,与人体内环境存在一定的差异;③巨噬细胞在疾病中是动态的发展,且表型较多,表现出的功能也不尽相同,如何精确地诱导巨噬细胞向M2型极化,达到促进创面愈合的效果,仍需要进一步的研究;④目前中药单体与水凝胶两者结合的研发与生产仍有一定的局限性,还需更深入的研究实现中药与医用水凝胶更完美的结合。

发展靶向治疗和发展一种可靠的方法来监测慢性伤口的辅助愈合是我们要追求的两个主要目标。此外,确定可以调节巨噬细胞极化的分子靶点以帮助慢性创伤组织修复是实现上述两个目标的关键步骤。在面对难愈性创面的治疗中,控制感染的同时,如果能够有效干预创面组织中巨噬细胞的极化方向,将对创面愈合具有重要意义,适当促进创面中M2型巨噬细胞的比例增加利于创面愈合。因此,研究调控巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化将是未来慢性难愈性创面治疗的可靠方向,可进一步的深入研究。