铜绿假单胞菌群体感应系统及其抑制剂的研究进展

周志莲 周彤 周秀娟 龙坤兰 陈骏 张传涛 高培阳

摘要：抗生素的过度使用导致了“超级细菌”的出现，铜绿假单胞菌是引起医疗相关感染的机会致病菌之一。铜绿假单胞菌临床分离株对常用抗菌药物的耐药性已成为严重的公共卫生问题。铜绿假单胞菌的致病性和耐药性被一种称为“群体感应”的复杂机制调节，其调节毒力因子的产生、生物膜形成、细菌对抗生素的耐药性、细菌运动等等，并可减弱宿主的免疫应答。群体感应抑制剂（quorum sensing inhibitors， QSIs）可以在不影响细菌生长的情况下降低细菌毒性，并可抑制和消除生物膜，增加抗生素对细菌的敏感性。这些特性使QSIs成为目前研发抗感染和辅助抗感染药物的热点，本文就铜绿假单胞菌的群体感应系统和铜绿假单胞菌QSIs的研究进展进行了综述。

关键词：群体感应系统；铜绿假单胞菌；群体感应抑制剂

中图分类号：R978.1  文献标志码：A

Study on quorum sensing system and its inhibitors of Pseudomonas aeruginosa

Zhou Zhilian， Zhou Tong， Zhou Xiujuan， Long Kunlan， Chen Jun， Zhang Chuantao， and Gao Peiyang

（Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610072）

Abstract The overuse of antibiotics has led to the emergence of "superbacteria". Pseudomonas aeruginosa is one of the opportunistic pathogens that causes medical-related infections. The resistance of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa to commonly used antibiotics has become a serious public health problem. The pathogenicity and drug resistance of Pseudomonas aeruginosa are regulated by a complex mechanism called “quorum sensing”. Quorum sensing regulates the production of virulence factors， biofilm formation， bacterial resistance to antibiotics， bacterial movement and so on， and can weaken the immune response of the host. Quorum sensing inhibitors （QSIs） can reduce bacterial toxicity without affecting bacterial growth， as well as inhibiting and eliminating biofilm， thus increasing the sensitivity of antibiotics to bacteria. These characteristics make QSIs a key focus in research into the development of anti-infective and adjuvant anti-infective drugs. This paper reviews the quorum sensing system of Pseudomonas aeruginosa and summarises progress in research into Pseudomonas aeruginosa QSIs.

Key words Quorum sensing system; Pseudomonas aeruginosa; Quorum sensing inhibitors

抗生素濫用导致的抗生素耐药性（antimicrobial resistance， AMR）已成为全球公共卫生问题。最近的一项评估估计，如果全球继续忽视AMR问题，到2050年，由此导致的人类死亡将达到1000万[1]，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa， PA）是一种运动型、带有单极鞭毛、需氧的芽胞杆菌[2]，是医院常见的机会致病菌之一，可引起多系统感染，包括消化系统、呼吸系统等。由于抗生素的滥用，多重甚至泛耐药铜绿假单胞菌的出现给临床治疗带来了巨大挑战[3-4]。研究显示，铜绿假单胞菌的致病性和耐药性与群体感应（quorum sensing， QS）有关。QS是广泛存在于细菌群体中的一种依赖细菌密度的信号系统[5]，可调节多种生物学特性，包括毒力基因的表达、细菌的运动及生物膜的形成[6]。最近，QS过程的抑制剂，群体猝灭（quorum quenching，QQ）酶和群体感应抑制剂（quorum sensing inhibitors，QSIs），已被开发用于降低细菌的毒力，从而在不干扰细菌生长的情况下抑制细菌毒力因子[7]，降低细菌耐药性[8]。本综述总结了铜绿假单胞菌的QS系统及其在生物膜形成过程中的作用。同时，还总结了QSIs和QQ酶的最新发展，作为设计新抗菌剂的可能策略。

1 群体感应系统与PA的群体感应系统

1.1 群体感应系统

群体感应是细胞与细胞之间的通讯方式[9]，广泛存在于自然界的微生物中，是一个依赖于细菌密度的基因调控系统[5]。细菌在生长过程中会产生和释放一种称为自诱导分子（auto inducers， AIs）的化学信号分子，其浓度随着细菌种群密度的增加而增加，当自诱导分子达到阈值后，就会与QS受体结合，调控多种基因的表达[10]，从而调节毒力因子的生成、生物膜形成和胞外多糖等，使细菌作为一个能够共同应对周围环境变化的群体，产生耐药性和毒力等不良后果[11]。通过QS系统表达致病性和耐药性包括以下步骤：①合成QS信号分子；②向环境释放信号分子；③高密度的信号分子与膜受体的感应和结合；④从细胞中提取受体信号复合物及其与启动子区的结合；⑤致病相关基因的转录[12]。大量研究发现，不同的微生物通过不同的化学信号进行群体感应：N-酰基高丝氨酸内酯类（acylhomoserine lactones， AHLs）及其衍生物主要作用于革兰阴性菌；氨基酸和短肽类（autoinducing peptides， AIPs）主要作用于革兰阳性菌；除这两大类AIs外，还报道了各种微生物对多种信号分子的使用，如铜绿假单胞菌以假单胞菌喹诺酮类信号（Pseudomonas quinolone signal，PQS）为信号分子等[13]。

1.2 铜绿假单胞菌的群体感应系统

铜绿假单胞菌主要通过las系统、rhl系统和pqs系统介导群体感应，详见图1，其中las系统和rhl系统属于AHLs介导的系统，这类系统由LuxI合成酶和LuxR受体蛋白组成。具体来说，las系统由LasI合成酶和LasR受体蛋白组成，rhl系统由RhlI合成酶和RhlR受体蛋白组成。在las系统中，LasI合成3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯（N-（3-oxododecanoyl）-L-homoserine lactone， 3-oxo-C12-HSL）作为该系统的AIs，当其达到阈值时，与LasR结合后激活LasR受体蛋白并形成复合物LasR-3OC12-HSL，直接或间接调控基因的表达。rhl系统和las系统的区别是其AIs为丁基高丝氨酸内酯（N-Butanoylhomo Serine lactone， C4-HSL），其形成的复合物是RhlR-C4-HSL。第三个pqs系统是仅在铜绿假单胞菌中发现的，它使用烷基-4-（1H） 喹诺酮类化合物（alkyl-4-（1H）-Quinolones， AQS）作为信号分子，AQS包括2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮（PQS）及其前体2-庚基-4-羟基喹啉（HHQ）。pqsABCD操纵子产生HHQ，HHQ经PqsH催化转化为PQS，而PqsR作为受体蛋白与信号分子结合以激活各种靶基因的转录[14]。研究表明las、rhl、pqs系统均可调节多种毒力因子的表达，如胞外酶、次级代谢物和毒素。rhl、pqs系统还可以调节鼠李糖脂的生成[15]。除了这3个QS系统外，还存在第四种群体感应系统，称为iqs系统，它的信号分子被称为IQS，iqs系统具有整合QS信号和应激反应方面的功能。iqs系统的中断会干扰pqs和rhl介导的QS信号。在营养充足的条件下iqs系统由las系统控制，其可通过限制磷酸盐被激活。iqs系统可以在lasI或lasR基因突变的情况下调控las系统，继续发挥铜绿假单胞菌QS系统的调节作用[16]。然而，最近的一项研究证实IQS是一种铜绿醛，是绿脓菌素生物合成或降解的副产物[17]。

在铜绿假单胞菌的QS网络中，各子系统彼此独立而又相互关联，存在级联调节机制。已有研究表明las系统中的lasRI基因位于其他系统的上游，是QS网络系统的主控因子，启动lasRI基因后可上调其他系统基因的表达[18]。另外，pqsR和pqsH基因能够被LasR-3OC12-HSL激活，而pqsABCD和pqsR又能被RhlR-C4-HSL抑制，PqsR-AQS信号分子AQS的分泌能够进一步上调rhlI和rhlR的表达[19]。总的来说，pqs系统与las和rhl系统相互联系，形成緊密而又高效的信号传递与交流的通路，共同调节菌体生理特性。

2 QS系统调节PA生物膜形成，增加抗生素耐药性

2.1 QS系统调节PA生物膜形成

铜绿假单胞菌QS网络中的las、rhl和pqs系统调节多种促进生物膜发育的分子产生，包括Pel多糖、鼠李糖脂、绿脓菌素、铁载体pyoverdine和凝集素等。Pel多糖在维持生物膜生长、成熟及结构维持中起决定作用。鼠李糖脂是一种含有鼠李糖的糖脂化合物，在后期生物膜形成过程中维持细胞聚集物之间的开放空间起着重要作用。绿脓菌素是一种有细胞毒性作用的次级代谢物，可诱导细胞裂解并将细胞DNA释放形成胞外DNA（extracellular DNA， eDNA）eDNA是生物膜成分之一，它可以与绿脓菌素结合，增加溶液黏度，进而增加生物膜基质与周围环境的相互作用，促进细胞聚集。铁载体pyoverdine是对铁具有高亲和力的荧光铁载体，它可以在环境中固定铁，并将其输送到细胞中，铁是生物膜形成的必要成分。凝集素（lectin， Lec）是位于外膜上的可溶性蛋白质，包括LecA和LecB，前者与半乳糖及其衍生物结合，后者与岩藻糖、甘露糖和含甘露糖的低聚糖结合。凝集素的这种黏附特性促进细胞和胞外多糖停留在生长的生物膜中，不仅有利于形成生物膜结构，还有利于黏附在上皮和黏膜等生物表面[17]。此外，核苷酸的第二信使，二磷酸鸟苷，是胞外聚合物（extracellular polymeric sub-stances， EPS）产生的关键调节因子，能使细菌细胞从能动阶段转变为固着阶段，并使粘附细胞处于生物膜状态[20]。既往研究已经证实QS信号分子可直接或间接地作用于二磷酸鸟苷，将复杂的环境信息信号转换为一般细胞内信号，促进生物膜形成[21]。总的来说，这种分子和细胞的交互作用再合并其他聚合物可促进形成一个稳固而成熟的生物膜[22]。

2.2 铜绿假单胞菌生物膜与抗生素耐药性

铜绿假单胞菌以生物膜和浮游生物两种形式存在，PA以生物膜的形式生长时表现出许多不同于浮游细胞的特性，一方面增强了对抗生素的耐药性，另一方面还可以对抗宿主免疫系统[23]，使得由PA生物膜引起的感染难以治疗和根除[24]。PA的生物膜由EPS基质包围的细胞构成，这种基质包含多糖、脂类、蛋白质、核酸和生物表面活性剂，它们有助于细胞的初始黏附，并为生物膜形成提供基本结构。其中EPS基质产生于生物膜发育后期高度自聚集时[20]。铜绿假单胞菌生物膜的形成包括4个主要步骤： 附着在表面，增殖，微菌落形成及成熟为一个结构化的耐药微生物群落[25]。

生物膜胞外多糖基质作为一种扩散屏障，阻止抗生素的扩散，并固定抗生素。此外，扩散障碍导致养分梯度的产生，使得细菌细胞的生长在生物膜的不同区域有所不同。生长在生物膜表面的细菌细胞代谢更加活跃，而内部细胞生长更加缓慢[26-27]。生物膜内部细胞生长速度下降和代谢活动的减少使持久性细胞增加[28]。一些抗生素，如大多数β-内酰胺类抗生素，仅对生长中的细胞有效，而少数抗生素，如多黏菌素，对生长条件差的细胞仍有杀伤作用[26]，Baek等[29]还观察到多黏菌素和环丙沙星联用可以清除持久细胞。一般来说，较低浓度的抗生素就可以杀死大多数铜绿假单胞菌生物膜细胞，但是即便增加它们的浓度也不能杀死持久细胞[30]。因此，研究人员得出结论，生物膜细胞中只有一小部分负责增强抗生素抗药性，大多数生物膜细胞对抗生素治疗仍然敏感[27]。既往研究证实，革兰阴性菌生物膜中含有更多的持久细胞，可能是因为它们的细胞壁含有脂多糖，进一步减弱了抗生素对细胞的渗透性[28]。

3 PA的群体感应抑制剂

QS在铜绿假单胞菌的致病性和多重耐药性中起着关键作用，它可以上调有关毒力基因、生物膜相关基质基因、外排泵基因的表达，不仅有助于铜绿假单胞菌的传播，还可以提高铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药性。治疗铜绿假单胞菌感染的一种有希望的新方法是在不杀死任何目标细菌的情况下阻断QS，近些年发现的QQ酶和QSIs可在不影響细菌生长的前提下，大大降低铜绿假单胞菌的毒性。这一作用使其不易诱导细菌耐药[31]，因此此类药物成为目前抗感染领域的研发热点。QQ酶和QSIs通过不同的机制发挥作用（以AHL luxI/luxR调控机制为例，如图2）：①抑制信号分子的合成；②酶降解信号分子；③与信号分子竞争结合相关受体位点；④干扰信号分子与基因启动子的结合并抑制基因表达；⑤通过抗体和环糊精等大分子清除AIs。最近，已经报道了许多类型的QSIs，它们可以是人工合成的，也可以来自大自然中，从陆地、海洋到淡水生态系统[13]。QSIs由多种生物体产生，如植物、动物、真菌或细菌。大多数已知的QSIs主要在植物和微生物中鉴定。这可能是由于对植物提取物和微生物的QSIs活性进行了更多的筛选[32]。近年来，人工合成的QSIs也越来越多地被报道。

3.1 人工合成QSIs

在铜绿假单胞菌的QS系统中，LasR位于级联传导的顶端，是铜绿假单胞菌多种QS系统的核心调节因子。因此，LasR蛋白是近年研究铜绿假单胞菌群体感应抑制的热门药物靶点。Dalal等[33]筛选了大量潮霉素系列小分子，通过原子分子动力学模拟和分子力学计算来描述它们抑制LasR蛋白的潜力。结果表明一部分潮霉素分子对LasR蛋白具有良好的结合亲和力，并可以形成稳定的LasR抑制剂复合物，这将有助于正在进行的新抗生素研究。Aflakian等[34]通过人工合成设计了新的抗菌肽WSF、FASK和YDVD，通过与LasR蛋白的转录激活物结合，在铜绿假单胞菌的QS系统中干扰LasR，并进一步抑制了生物膜生成、生物膜相关基因AlgC、PslA和PelA的表达和浮游铜绿假单胞菌生长。

3.2 天然植物来源QSIs

除了人工合成化合物以及微生物次级代谢产物，天然植物及其次级化合物逐渐受到科学家们的重视，尤其是2015年之后，相关研究文献激增[35]。大豆异黄酮（soy isoflavones， SI）是一组富含于大豆和其他豆类的酚类化合物，Yin等[36]通过体外实验发现SI与铜绿假单胞菌的AHLs有很好的竞争性结合作用，对生物膜的形成，毒力因子、AHLs的产生以及QS相关基因的表达水平具有显著的抑制作用。绿原酸（chlorogenic acid， CA）是一种在蔬菜、水果和中药中含量丰富的酚类化合物，Xu等[37]将CA应用于耐多药铜绿假单胞菌临床分离株的QQ试验，发现绿原酸能够下调lasI、lasR、rhlI、rhlR、pqsA和pqsR基因的表达，抑制了耐多药铜绿假单胞菌生物膜的形成，可以作为治疗临床铜绿假单胞菌感染的抗毒力因子。El-Sayed等[38]用70%乙醇萃取获得绿茶提取物，通过体外实验证明其对PA的lasI、lasR、rhlI和rhlR基因转录有较强的抑制作用，其抑制率分别约为92%、96%、95%、95%和93%，并且，在亚MIC下，绿茶提取物对PA生物膜抑制率高达85%，这项研究表明未来有希望减少对抗生素的依赖。α-松油醇（α-terpineol， αT）是一种香料，是从松树、茶树等植物中提取的精油的组成部分。Bose等[39]使用含有αT的游离纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers， NLCs）作用于PA，体外实验发现αT-NLCs显著降低PA的毒力基因rhlAB、aprA、lasB、toxA、plcH和关键QS基因las和rhl的表达水平。同时也显著降低EPS、溶血素、弹性蛋白酶和绿脓菌素的产生，另外，还抑制了PA的游泳运动和生物膜形成。电子分析还表明，αT-NLCs对QS受体lasR、rhlR和pqsR有很强的结合亲和力。基于αT-NLCs体外的强群体感应抑制活性，Bose等[40]还以铜绿假单胞菌感染小鼠角膜炎为模型，探讨了αT-NLCs对铜绿假单胞菌诱导的角膜炎的治疗效果，具体来说，经αT-NLCs治疗后，角膜组织中的细菌数量显著减少，并改善了角膜组织病理学，减少了炎症标记物水平。这是少有的体内实验的研究结果。松油烯-4-醇是αT的异构体，是茶树油中主要的单氧萜类活性成分，Bose等[41]观察到松油素-4-醇、环丙沙星单独使用均可抑制PA的毒力因子和生物膜的产生，并减少成熟生物膜的数量，另外，还观察到松油烯-4-醇和环丙沙星联用使PA的毒力因子的产生最大程度的降低。使QSI与抗生素联用成为另一种治疗感染的可能。

3.3 传统中药来源QSIs

此外，传统中药及其次级化合物在抑制QS方面的研究也在日益增多，如黄芩苷，姜辣素、姜烯酮、姜油酮（生姜的酚类化合物）及它们的衍生物，肉桂醛和丹皮酚等[1，42]，已有相关综述在前，不再赘述。值得一提的是，最近的研究显示，肉桂醛和抗生素联用表现出更强烈的群体感应抑制活性，具体来说：肉桂醛单独诱导lasB、rhlA和pqsA基因的抑制分别约为50%、60%和45%，而肉桂醛和妥布霉素联合使用可降低lasR表达约70%，抑制rhlR和PQS分别为64.7%和69.4%。此外，与单独作用相比，肉桂醛与黏菌素和肉桂醛与妥布霉素在生物膜抑制和预成生物膜分散中具有相加活性[43]。Subhaswaraj等[44]为了解决生物利用度问题，开发出亚MIC水平的肉桂醛包覆壳聚糖纳米粒（cinnamaldehyde encapsulated chitosan nanopart-icles，CANPs），结果表明，与肉桂醛单独使用相比，CANPs通过下调QS调节的毒力因子和相关的生物膜形成，显示出更显著的抗群体感应活性，并可显著抑制PA的游泳和群集运动。

4 總结和展望

生物膜相关感染治疗困难，也更容易引起复发，找到有针对性的治疗措施，是临床抗感染中急需解决的问题，QQ酶和QSIs以细菌QS系统作为靶标防治细菌感染，不仅可以减少毒力因子的产生，降低细菌致病性，还可以抑制生物膜的产生和清除成熟生物膜，增加抗生素对细菌的敏感性。如果在治疗中较早使用，则会延迟甚至消除耐药性，使其可能成为优良的辅助抗菌药物，越来越多的研究已经证明抗生素和QSI合用可以发挥协同作用，不仅可以减少药物的剂量和不良反应，还能延缓细菌耐药速度。并且随着纳米技术与QSIs的碰撞，更是解决了传统QSIs的生物利用度的问题。由于QSIs并不杀死或抑制细菌生长，使得细菌不易产生抗药性[45]。然而目前的研究成果大多还停留在体外试验和体内动物实验，这些研究成果还需要进一步验证，才能成功过渡并转化为应用医学，从而在临床环境中对抗铜绿假单胞菌的感染。

参 考 文 献

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