5个恶唑烷酮类新化合物对铜绿假单胞菌群体感应系统的抑制研究

汤倩玲?温福龙?袁阳?吴怡?马文博?褚以文?赵克雷

摘要：目的 以铜绿假单胞菌PAO1为模式菌，研究恶唑烷酮类新化合物对铜绿假单胞菌群体感应系统的抑制作用及其作用机制。 方法 测定5个恶唑烷酮类新化合物对PAO1生物膜、绿脓菌素、运动能力抑制活性，采用qRT-PCR测试其对群体感应相关基因的下调作用，并评估化合物对秀丽隐杆线虫感染模型的保护活性。结果 化合物SIIA-MA2与SIIA-MA4对PAO1生物膜、绿脓菌素、运动能力具有较强的抑制活性，其作用机制均是并显著下调PAO1中10个已知的受群体感应系统正调控的基因。化合物SIIA-MA2与SIIA-MA4对秀丽隐杆线虫感染模型具有良好的体内保护活性，其中化合物SIIA-MA2对急性感染模型具有显著保护活性；化合物SIIA-MA4对慢性感染模型具有显著保护活性。结论 恶唑烷酮类新化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4通过抑制PAO1群体感应系统发挥抗感染作用。

关键词：恶唑烷酮类化合物；铜绿假单胞菌；群体感应；群体感应抑制剂

中图分类号：R978.1文献标志码：A

Study on inhibition of quorum sensing system of Pseudomonas aeruginosa by five novel oxazolidinones

Tang Qianling， Wen Fulong， Yuan Yang， Wu Yi， Ma Wenbo， Chu Yiwen， and Zhao Kelei

（Antibiotics Research and Re-evaluation Key Laboratory of Sichuan Province， Sichuan Industrial Institute of Antibiotics， School of Pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106）

Abstract Objective To evaluate the inhibitory activities of novel oxazolidinone compounds on the quorum sensing （QS） system of P. aeruginosa reference strain PAO1. Methods The influences of five novel oxazolidinones on the QS system， biofilm formation， pyocyanin formation， and motility ability of P. aeruginosa PAO1 were tested， followed by checking the expression of 10 typical genes that are positively regulated by the QS system of P. aeruginosa using qRT-PCR. Caenorhabditis elegans-P. aeruginosa PAO1 infection model was employed to explore the in vivo protective effect of compounds SIIA-MA2 and SIIA-MA4.  Results Compounds SIIA-MA2 and SIIA-MA4 significantly inhibited the production of biofilm， pyocyanin， and bacterial motility of P. aeruginosa PAO1， and the expression levels of QS-controlled genes were significantly down-regulated. Furthermore， the treatment of compound SIIA-MA2 significantly protected C. elegans from the fast-killing of P. aeruginosa PAO1， while the compound SIIA-MA4 mainly functioned in the slow-killing assay. Conclusion This study reveals anti-QS activities of the new oxazolidinone compounds SIIA-MA2 and SIIA-MA4 against P. aeruginosa， and provides a method for the discovery of novel anti-infectious drugs.

Key words Oxazolidinones; Pseudomonas aeruginosa; Quorum sensing; Quorum sensing inhibitor

銅绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa， PA）是一种条件致病菌，容易导致局部感染和全身感染，患有免疫功能受损疾病（如囊性纤维化、癌症和艾滋病）的患者更易感染。PA通过毒力因子产生致病性，其固有耐药与生物膜相关[1]。PA的生物膜形成和多数胞外毒力因子的合成和分泌都受群体感应系统（quorum sensing， QS）调控，QS在PA的致病性和耐药性中起着重要作用[2]。PA具有las、rhl与pqs等3个QS调控系统，且las系统能够正向调控其余两个系统，QS抑制剂的开发对防控PA的感染与耐药性具有重要意义[3]。

本研究前期通过分子对接技术对自建化合物库中的化合物进行虚拟筛选，得到了22个恶唑烷酮类新化合物，利用M9-腺苷培养基与LB培养基进行差异性培养筛选[4]，在50 μmol/L的化合物浓度下经初筛得到5种活性化合物（图1），再设置25、50、100、200 μmol/L的浓度梯度开展量效关系研究，最终确定了50 μmol/L为最适抑制浓度。本文报道5个化合物对PA生物膜、绿脓菌素及运动能力的抑制作用，以及活性化合物SIIA-MA2与SIIA-MA4对QS相关基因表达的下调作用和对秀丽隐杆线虫感染模型的保护活性。

1 材料

1.1 供试化合物

按照文献方法[5]合成纯度大于95%的化合物，配成浓度为10 mg/mL二甲亚砜（DMSO）溶液，经肉汤稀释法[6]测定5种化合物对PAO1的最小抑菌浓度均大于1024 μg/mL，均为无直接杀菌作用的化合物。

1.2 菌株及线虫

野生型铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1）由本实验室保存，嘧啶缺陷型大肠埃希菌OP50（Escherichia coli OP50）及野生型秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）N2由加拿大戴尔豪斯大学Balakrishnan Prithiviraj博士惠赠。

1.3 培养基

秀丽隐杆线虫感染试验采用快杀培养基（peptone-glucose-sorbitol agar media，PGS）和慢杀培养基（slow killing agar media，SK）[7]。

1.4 试剂

DMSO、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化铵、氯化钙、七水硫酸镁、腺苷乙醇、三氯甲烷为分析纯，购于成都市科隆化学品有限公司；结晶紫染料购于Solarbio公司；细菌RNA提取试剂盒购于福际生物有限公司；逆转录试剂盒和SYBR Green qPCR试剂盒，购于Takara Bio公司。

1.5 仪器

LDZM-80KCS-II立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1FD超净工作台，浙江孚夏医疗科技有限公司；CMax Plus酶标仪，Molecular Devices公司；UV5500PC型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；CFX96荧光定量PCR仪，美国BIO-RAD公司；SMZ168体式显微镜，杭州欧尔柏维科技有限公司。

2 方法

2.1 化合物生物膜抑制活性检测

参照Hwang等[8]的方法，利用结晶紫染色法检测5个化合物对PAO1生物膜产量的抑制作用。初筛活性化合物的终浓度设置为50 μmol/L，设置DMSO为空白对照。

2.2 化合物绿脓菌素抑制活性检测

参照Chakraborty等[9]的方法，将5个化合物的终浓度设置为50 μmol/L，设置DMSO为空白对照。

2.3 化合物运动能力抑制活性检测

参照Ghosh等[10]的方法，利用琼脂浓度为0.5%的LB固体培养基研究5个化合物在50 μmol/L浓度下对PAO1游动能力的抑制活性，利用琼脂浓度为1%的LB固体培养基研究化合物在50 μmol/L浓度下对PAO1震动能力的抑制活性，以mm为单位测量菌落在培养基上形成的菌落直径大小。设置DMSO处理组为空白对照组。

2.4 化合物SIIA-MA4、SIIA-MA2对QS相关基因表达量的影响

按照细菌总RNA提取试剂盒的操作方法提取对照组与SIIA-MA2、SIIA-MA4处理组PAO1总RNA。将上述PAO1总RNA反转录为cDNA，采用Zhao等[11-12]设计的QS正调基因特异引物，使用SYBR Green qPCR试剂盒与CFX96荧光定量PCR仪定量分析SIIA-MA2与SIIA-MA4对相关调控基因以及功能基因表达量的影响。以PAO1的16S rRNA作为内参基因，通过2-??Ct计算方法将每个目标基因的相对表达量标准化。

2.5 化合物SIIA-MA4和SIIA-MA2对PAO1感染秀丽隐杆线虫的保护活性

参照Tan等[7]的方法，分别挑取10只处于L4期的秀丽隐杆线虫于PGS培养基与SK培养基上，分别于20 ℃恒温培养箱培养80和11 d，观察记录线虫存活情况，设置给药组和DMSO对照组。

2.6 统计方法

实验数据均为3次生物学重复的平均值±标准误差，使用GraphPad Prism 8进行ANOVA检验，使用log-rank （Mantel-Cox） test对线虫生长曲线进行生存曲线差异度比较；以P<0.05时判定具有显著性差异，P < 0.01时判定具有极显著性差异。

3 结果

3.1 化合物抑制PAO1生物膜和绿脓菌素的生成

与DMSO对照组相比，化合物SIIA-MA1、SIIA-MA3与SIIA-MA5在50 μmol/L时对PAO1生物膜和绿脓菌素无显著抑制作用（P>0.05）。而50 μmol/L浓度的化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4处理过的PAO1生物膜产量均显著减少（图2a），化合物SIIA-MA2对PAO1生物膜产量有极显著的抑制作用（P<0.01）；化合物SIIA-MA4对PAO1生物膜的产量有显著性抑制作用（P<0.05）。化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4在50 μmol/L終浓度的条件下，对PAO1绿脓菌素产量均有极显著的抑制作用（图2b）。

3.2 化合物抑制PAO1运动能力

在琼脂浓度为0.5%的LB固体培养基中，与DMSO对照组相比，化合物SIIA-MA1、SIIA-MA3与SIIA-MA5在50 μmol/L时对PAO1运动能力无显著抑制作用，但化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4对PAO1的游动能力显示出极显著抑制作用（P<0.0001）（图3 a）。在琼脂浓度为1%的LB固体培养基中（图4b），与DMSO对照组相比，化合物SIIA-MA2和SIIA-MA4在50 μmol/L的终浓度下，对PAO1的震颤能力显示出极显著抑制作用（P<0.01）。

3.3 化合物SIIA-MA2与SIIA-MA4抑制QS相关毒力基因的表达

与DMSO对照组相比，化合物SIIA-MA2作用下的PAO1群体感应系统调控基因lasR、rhlR、pqsR和下游功能基因lasB、rhlA、pqsA、pqsE、pqsD、hcnA和phzA1的表达水平均呈现不同程度的下调，其中调控基因lasR具有极显著差异（P<0.001）。化合物SIIA-MA4作用下的QS调控基因表达水平也均有不同程度的下调，其中调控基因lasR的下调具有极显著差异（P<0.01），同时，rhlR与pqsR两个调控基因下调均有极显著差异（P<0.001）。表明化合物SIIA-MA2与SIIA-MA4通过同时抑制3个QS系统产生对PA的抑菌活性。

3.4 化合物SIIA-MA2与SIIA-MA4对PAO1感染秀丽隐杆线虫的保护活性

结果表明，化合物SIIA-MA2对急性感染PA的秀丽隐杆线虫有显著保护作用，化合SIIA-MA4对慢性感染PA的秀丽隐杆线虫有显著保护作用。

在急性感染模型中（图5a和图5c），DMSO对照组中的线虫在20 h开始死亡，在40 h时死亡率达到50%；在80 h时线虫已完全死亡，而化合物SIIA-MA2给药组的线虫在40 h时开始死亡，在80 h时仍有50%的存活率，有显著性差异（图5a）；化合物SIIA-MA4给药组的线虫在40 h时开始死亡，在80 h时，有25%的存活率，但无显著性差异（图5c）。

在慢性感染模型中（图5b和图5d），DMSO对照组的线虫在第10天时死亡率达到100%，而化合物SIIA-MA2处理过的线虫整体死亡速率更慢，但无显著性差异（图5b）。DMSO对照中的线虫在第9天时全部死亡，而化合物SIIA-MA4给药组在第9天的时候线虫存活率为40%，具有显著性差异（图5d）。

4 讨论

恶唑烷酮类抗菌药物是继喹诺酮类和磺胺类后研发的第三类化学全合成抗菌药物，对常见耐药革兰阳性菌如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等有治疗效果。第一个恶唑烷酮类药物是利奈唑胺，于2000年4月在美国上市，对革兰阳性菌有良好的抑菌作用，暂无抑制PA群体感应方面的研究。辉瑞公司用二氢噻嗪类替代C环合成了一系列衍生物，将恶唑烷酮类化合物原有的抗菌谱扩大到革兰阴性菌[13]。曾善超等[14]和Jiang等[15]以3-氨基-2-恶唑烷酮为骨架设计合成了一系列衍生物，得到化合物XYL-13与Z2，化合物XYL-13在576 μmol/L的浓度下有效抑制PA生物膜、绿脓菌素产量，抑制PA的运动能力；利用紫色色杆菌CV026在125 μmol/L时筛选出化合物Z2有QS抑制作用。

本研究在前期采用分子对接技术预测恶唑烷酮类化合物与LasR的结合位点过程中，发现利奈唑胺结构中的恶唑烷酮杂环和苯环基团是重要结合位点。因此以恶唑烷酮杂环和苯环为基本骨架合成了22個新结构衍生物，经抗QS活性初筛获得了本文报道的5个目标化合物，结合5个化合物的体外抗QS表型试验结果和化学结构，推测化合物苯环上的甲氧基基团是该类化合物抑制QS活性所必需的，而结构中苯环上的卤素基团不利于抑制活性的保持。化合物SIIA-MA2与SIIA-MA4，能在50 μmol/L的低浓度下较显著的抑制PA的QS系统及相关毒力因子。在秀丽隐杆线虫感染保护实验中，化合物SIIA-MA2与SIIA-MA4在PA的急性感染和慢性感染中表现出了不同的保护活性，化合物SIIA-MA2对线虫的急性感染模型有显著保护活性，化合物SIIA-MA4对线虫的慢性感染模型有显著保护活性，可能与化合物SIIA-MA2的苯环上比化合物SIIA-MA4多一个甲基有关，有研究表明药物分子中引入甲基能够增加分子对靶蛋白的亲和力[16]，两个化合物体内活性的差异需要更深入的构效关系研究加以阐明。

参 考 文 献

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收稿日期：2022-11-14

基金项目：四川省科技厅杰出青年科技基金项目（No. 2021JDJQ0042）；成都大学高层次人才培育项目（No. 2081920066）

作者简介：汤倩玲，女，生于1997年，在读硕士研究生，研究方向为先导化合物开发，E-mail： tql875@sina.com

*通信作者，E-mail： zhaokelei@cdu.edu.cn