LncRNA BLACAT1 调节miR-324-5p/MAP4K3 轴对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

廖运国 ,唐梓瑜 ,李超 ,蒲嘉骐 ,邱世香 ,杨甜

1南充市中心医院介入医学科 四川省南充市,637000 2南充市高坪区人民医院肿瘤科 四川省南充市,637100

肝癌是一种常见的恶性肿瘤,其具有早期症状不明显,发生发展较快等特点,在我国的发病率和死亡率都很高[1]。随着科技进步,常规的肝癌治疗方法如手术、放化疗等有所改进和提高,但是治疗效果仍然不是很理想,给人们的心理和生理带来了极大的负担[2]。因此寻找更加有效的治疗肝癌的方法十分重要。长链非编码RNA (long non-coding RNA,LncRNA) 是一种长度超过200 个核苷酸的非编码RNA。既往研究发现,在肝癌患者组织和血清中有大量异常表达的LncRNA,其中有一些LncRNA 被证实是抑制肝癌发生发展的重要调控因子[3-5]。

已有研究报道,长链非编码RNA 膀胱癌相关转录本1 (long chain noncoding RNA bladder cancer associated transcript 1,LncRNA BLACAT1) 位于人类染色体1q32.1 的基因座上,其在人肝癌肿瘤和细胞中都过表达,抑制BLACAT1 具有抑制肝癌肿瘤的作用[6]。在肝癌中下调miR-324-5p 可促进细胞的迁移和侵袭[7],而丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶3 (mitogen activated protein kinase kinase kinase kinase 3,MAP4K3) 下调可阻滞肝癌细胞周期进程,抑制恶性增殖[8]。本研究通过生物信息学发现,BLACAT1 与miR-324-5p 存在调控关系,miR-324-5p 与MAP4K3 可靶向结合。而BLACAT1能否通过调控miR-324-5p/MAP4K3 轴影响人肝癌细胞增殖、迁移和侵袭尚不明确。因此,本研究主要探究BLACAT1 对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响以及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

于2020 年6 月至2022 年12 月选取本院收治的50 例肝癌患者,其中男27 例,女23 例,年龄28～69 岁,收集手术中切除的癌组织及相应的癌旁组织,并储存在液氮中。所有患者术前均未接受放疗、化疗及其他相关抗癌治疗。所有患者均签署知情同意书,并获得医院伦理委员会的批准。

人正常肝细胞(HL-7702) 和人肝癌细胞系(Huh-7、SMMC-7721、MHCC97L) 购自中国上海中科院细胞库。

1.2 主要试剂

CCK-8 试剂盒(货号: CK04) 购自上海经科化学公司;兔源一抗MAP4K3 (克隆号: SB46b(HRP))、PCNA (克隆号: IPO-38)、MMP2 (克隆号: AB13a)、MMP9 (克隆 号: 5C3)、c-Myc(克隆号: 2D5)、Cyclin D1 (克隆号: EP12) 以及二抗(货号: ab6721) 均购自Abcam 公司;LipofectamineTM2000 Reagent (货号: ab136465) 购自美国Invitrogen 公司;LncRNA BLACAT1 敲低质粒(si-BLACAT1) 及对照 (si-NC),miR-324-5p抑制剂 (miR-324-5p inhibitor) 及对照 (miRNC)、LncRNA BLACAT1 及miR-324-5p 引物购自广州RiboBio。

1.3 细胞培养

将HL-7702 和Huh-7、SMMC-7721、MHCC97 L 细胞置于含10 % 胎牛血清、1 % 青-链霉素的RPMI 1640 培养基中,在37 ℃、5 % CO2的稳定环境中常规培养,定期观察,每3 天更换一次培养基,当细胞融合度达到85 %以上时,消化传代,收集对数期的细胞进行实验。

1.4 实时荧光定量PCR (RT-qPCR) 法检测BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表达

使用Trizol 试剂提取组织和细胞中的总RNA,将RNA 逆转录为cDNA,逆转录条件: 16 ℃30 min;42 ℃30 min;75 ℃,15 min。以cDNA 为模板上RT-qPCR 仪进行扩增。反应体系50 μL,其中Taq/RTase Mix Ⅱ2 μL,2 ×One Step RT-PCR Buffer 25 μL,上下游引物(10 μmol/L) 各1 μL,加双蒸水至50 μL。BLACAT1: 正向引物为5′-ACAGAGAGTGGCCTGAT-3′,反向引物为5′-ATCCTTCCAAATCCCCTACG-3′;miR-324-5p: 正向引物为5′-GAGGCGAAGCCCTGGTATG-3′,反向引物为5′-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3′;MAP4K3 mRNA:正向引物为5′-AACTTCCCGACAGTGAGGTT-3′,反向引物为 5′-CACCTTGGTGTCCTTGTCCAT-3′;GAPDH: 正向引物为5′-CCTTCCGTGTCACT-3′,反向引物为5′-GCCTGCTTCACCACCTTC-3′;U6: 正向引物为5′-AACGCTTCACGAATTGCGT-3′,反 向引物为5′-CTCGCTTCGGCACACA-3′。分别以GAPDH、U6 为内参,采用2-ΔΔCT计算不同组织和细胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 的相对表达量。

1.5 细胞转染

将对数期的Huh-7 细胞分为ctrl 组(正常培养的Huh-7 细胞)、si-NC 组(转染si-NC)、si-BLACAT1 组(转染si-BLACAT1)、si-BLACAT1 +miRNC 组(si-BLACAT1 和miR-NC 共转染)、si-BLACAT1+miR-324-5p inhibitor 组 (si-BLACAT1 和miR-324-5p inhibitor 共转染)。按照脂质体法(Lipofectamine 2000) 操作步骤对上述各组Huh-7 细胞进行转染24 h。

1.6 RT-qPCR 法检测各组细胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表达

检测各组Huh-7 细胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 的表达,具体操作同1.4。

1.7 CCK-8 法检测细胞增殖

各组细胞以1 ×104个/孔接种到96 孔板中。分别将细胞培养24、48、72 h 后,弃去细胞上清液,且在指定的时间点向每个孔中加入含有10 μL CCK-8 溶液的100 μL 完全培养基。孵育2 h 后,使用酶标仪检测吸光度。

1.8 划痕实验检测细胞迁移

取各组转染细胞,将细胞密度调节至5 ×105个/mL,接种到35 mm 培养皿中,定期孵育直到大约90 %汇合。采用20 μL 移液器枪头进行划痕,后置于37 ℃,5 % CO2培养箱中培养,培养24 h后,显微镜下分别拍照记录0、24 h 时细胞的划痕宽度。划痕愈合率(%)=(0 h 时划痕宽度-24 h 时划痕宽度)/0 h 时划痕宽度×100 %。

1.9 Transwell 小室实验检测细胞侵袭

取各组干预24 h 的细胞,用胰蛋白酶消化,离心,之后制成细胞悬液,调整浓度为1 ×105个/孔。取-20 ℃保存的基质胶放4 ℃过夜融化后稀释,每小室加入100 μL 基质胶稀释液,置37 ℃,5 % CO2培养箱培养5 h,使其呈干胶状。将Transwell 小室放入6 孔板中,取细胞悬液加入上室,下室加入10 % FBS 的培养基,继续培养24 h。取出下室,弃上清,甲醇固定。晾干后,结晶紫染色后清洗,将小室倒置于显微镜上,每孔随机选5 个不同区域,在显微镜下观察拍照,Image-J 图像分析软件计算侵袭细胞数。细胞侵袭率(%)=下室细胞数量/细胞总数量×100 %。

1.10 Western 印迹检测蛋白表达

利用RIPA 裂解缓冲液充分裂解各组转染后的细胞,提取细胞总蛋白。BCA 法测定蛋白浓度并使蛋白煮沸变性。每个样品取20 μg 蛋白进行电泳分离蛋白,100 V 恒压转移蛋白至PVDF 膜上,用5 %的脱脂牛奶封闭2 h,将膜与一抗MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9、c-Myc、Cyclin D1、GAPDH,在4 ℃孵育过夜,再将膜与HRP 偶联的羊抗兔二抗在室温下孵育2 h,弃去液体,洗涤3 次,加入ECL 试剂观察蛋白质印迹,Image J 软件评估蛋白的灰度值。

1.11 双荧光素酶报告基因实验

构建BLACAT1 野生型质粒(BLACAT1-WT)和突变型质粒 (BLACAT1-MUT),将BLACAT1-WT 和BLACAT1-MUT 分别与miR-NC 或miR-324-5p mimic 共转染于Huh-7 细胞,48 h 后,检测荧光素酶活性。

构建MAP4K3 野生型质粒(MAP4K3-WT) 和突变型质粒(MAP4K3-MUT),将MAP4K3-WT 和MAP4K3-MUT 分别与miR-NC 或miR-324-5p mimic共转染于Huh-7 细胞,48 h 后,检测荧光素酶活性。

1.12 统计分析

Graphpad Prism 7.0 软件用于分析数据。所有细胞实验重复6 次。符合正态分布数据表示为平均值±标准差()。单因素方差分析用于多组间的比较,进一步两组间的比较采用SNK-q检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组织和细胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表达比较

RT-qPCR 结果显示,与癌旁组织相比,肝癌组织中BLACAT1、MAP4K3 mRNA 表达显著增加,miR-324-5p表达显著降低(P＜0.05) (表1)。

表1 比较组织中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表达(,n=50)

表1 比较组织中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表达(,n=50)

与癌旁组织比较,*P＜0.05

为了进一步明确BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 在肝癌发生发展中的作用,经RT-qPCR实验检测其在不同肝癌细胞(SMMC-7721、MHCC97L、Huh-7) 和HL-7702 细胞中的表达情况,结果显示与HL-7702 细胞相比,Huh-7、SMMC-7721、MHCC97L 细 胞BLACAT1、MAP4K3 mRNA表达水平显著增加(P＜0.05),miR-324-5p表达显著降低(P＜0.05),以Huh-7 细胞中变化最为显著并作为后续研究对象(图1)。

图1 细胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表达比较

2.2 各组 Huh-7 细胞中 BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表达比较

转染si-BLACAT1 以及si-BLACAT1 和miR-324-5p inhibitor 共转染后,经RT-qPCR 验证各组转染效率,结果显示,与ctrl 组、si-NC 组比较,si-BLACAT1 组Huh-7 细胞中BLACAT1、MAP4K3 mRNA 表达显著降低、miR-324-5p表达显著升高(P＜0.05);与si-BLACAT1 组、si-BLACAT1+miR-NC组比较,si-BLACAT1+miR-324-5p inhibitor 组Huh-7细胞中BLACAT1 表达变化差异无统计学意义(P＞0.05),MAP4K3 mRNA 表达显著升高(P＜0.05),miR-324-5p表达显著降低(P＜0.05,图2)。

图2 各组Huh-7 细胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA 表达比较

2.3 各组Huh-7 细胞增殖能力比较

经CCK-8 实验检测LncRNA BLACAT1 调控miR-324-5p/MAP4K3 轴对细胞增殖的影响,结果显示,与ctrl 组、si-NC 组比较,si-BLACAT1 组Huh-7 细胞A450值显著降低(P＜0.05);与si-BLACAT1 组、si-BLACAT1+miR-NC 组比较,si-BLACAT1 +miR-324-5p inhibitor 组Huh-7 细胞A450值显著升高(P＜0.05,表2)。

表2 各组Huh-7 细胞A450值比较

2.4 各组Huh-7 细胞迁移能力比较

通过敲低BLACAT1 表达以及敲低BLACAT1的同时抑制miR-324-5p 表达,经划痕实验检测其对细胞迁移的影响。

结果显示,与ctrl 组、si-NC 组相比较,si-BLACAT1 组Huh-7 细胞划痕愈合率显著降低(P＜0.05);与si-BLACAT1 组、si-BLACAT1+miR-NC组相比较,si-BLACAT1+miR-324-5p inhibitor 组Huh-7 细胞划痕愈合率显著升高(P＜0.05) (图3)。

2.5 各组Huh-7 细胞侵袭情况比较

经Transwell 实验检测LncRNA BLACAT1 调控miR-324-5p/MAP4K3 轴对细胞侵袭的影响,结果显示,与ctrl 组、si-NC 组比较,si-BLACAT1 组Huh-7 细胞侵袭率显著降低 (P＜0.05);与si-BLACAT1 组、si-BLACAT1+miR-NC 组比 较,si-BLACAT1 +miR-324-5p inhibitor 组Huh-7 细胞侵袭率显著升高(P＜0.05,图4)。

图4 Transwell 实验检测Huh-7 细胞侵袭(×100)

2.6 各组 Huh-7 细胞中 MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9 蛋白表达比较

采用Western 印迹法验证转染si-BLACAT1 以及si-BLACAT1 和miR-324-5p inhibitor 共转染后对细胞MAP4K3 以及与增殖、迁移和侵袭相关的蛋白表达,结果显示,与ctrl 组、si-NC 组比较,si-BLACAT1 组Huh-7 细胞MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9、c-Myc、Cyclin D1 蛋白表达显著降低(P＜0.05);与si-BLACAT1 组、si-BLACAT1+miR-NC组比较,si-BLACAT1 +miR-324-5p inhibitor 组Huh-7 细胞MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9、c-Myc、Cyclin D1 蛋白表达显著升高(P＜0.05) (图5,表3)。

图5 Western 印迹检测Huh-7 细胞中MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9 蛋白表达

表3 各组Huh-7 细胞中MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9 蛋白表达比较

2.7 双荧光素酶报告基因检测结果

为了验证miR-324-5p 分别与LncRNA BLACAT1、MAP4K3 之间的靶向关系,本研究分别利用Starbase、TargetScan 网站预测BLACAT1 与miR-324-5p、miR-324-5p 与MAP4K3 的结合位点。采用双荧光素酶报告基因检测实验证实LncRNA BLACAT1 与miR-324-5p 之间的靶向关系,结果显示,与miR-NC 和BLACAT1-WT 共转染组比较,miR-324-5p mimic 和BLACAT1-WT 共转染组荧光素酶活性显著降低 (P＜0.05);与miR-NC 和BLACAT1-MUT 共转染组比较,miR-324-5p mimic 和BLACAT1-MUT 共转染组荧光素酶活性差异无统计学意义(P＞0.05)。采用双荧光素酶报告基因检测实验证实miR-324-5p 与MAP4K3 之间的靶向关系,结果显示,与miR-NC 和MAP4K3-WT 共转染组比较,miR-324-5p mimic 和MAP4K3-WT 共转染组的荧光素酶活性显著降低(P＜0.05);与miRNC 和MAP4K3-MUT 共转染组比较,miR-324-5p mimic 和MAP4K3-MUT 共转染组荧光素酶活性变化差异无统计学意义(P＞0.05,图6)。

图6 BLACAT1、miR-324-5p 和MAP4K3 之间关系鉴定

3 讨论

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其发现时通常已经处于发展的终末期,患者的生存质量严重下降,严重威胁着人们的生命健康[9]。随着医学领域的不断发展,肝癌患者的生存率虽然有一定的提高,但术后复发率依然较高,放化疗的治疗效果也并不理想,肝癌的治疗并未得到根本改善[10]。因此,寻找更加经济高效的治疗方法对肝癌的治疗有着重要的意义。

研究表明,LncRNA 参与了多种疾病尤其是肿瘤发生发展的调控过程,在肝癌治疗中的地位不言而喻。有研究证实,LncRNA TPT1-AS1 敲低可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭[11]。还有研究表明,LncRNA NEAT1 在肝癌组织中表达增加,下调LncRNA NEAT1 可促进肝癌细胞凋亡,抑制细胞周期,进而抑制肝癌细胞增殖和侵袭[12]。研究发现,LncRNA BLACAT1 在多种癌症中异常表达,包括宫颈癌、前列腺癌、胃癌、结直肠癌等,例如,有研究表明,敲降LncRNA BLACAT1 显著抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[13]。Liao 等[14]研究证实,BLACAT1 在前列腺癌组织中的表达异常升高,敲低BLACAT1 可显著抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移能力。但LncRNA BLACAT1 在肝癌中的表达以及作用机制尚不清楚。本研究通过RTqPCR 实验检测,结果显示在肝癌组织和细胞中BLACAT1 表达增加,经细胞转染si-BLACAT1 后,得出敲减BLACAT1 可降低Huh-7 细胞的A450值、侵袭率、迁移率、PCNA、MMP2、MMP9、c-Myc和Cyclin D1 表达,提示敲减BLACAT1 可降低肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。这与上述研究结果一致[13-14]。

LncRNA 的分子功能是多方面的,可充当miRNA 海绵,而miRNAs 进一步通过与靶基因的3′非翻译区结合调节靶基因的表达,从而控制多种生物学功能。微小RNA (microRNA,miRNA) 是一类含有15～18 个核苷酸的非编码RNA,在人类癌症进展中起着至关重要的作用[15]。miR-324-5p 是一种miRNA,其定位于17p13.1,有研究证实,过表达miR-324-5p 在体外显著抑制了胆囊癌细胞的迁移、侵袭和上皮间充质转化,并阻碍了胆囊癌细胞在体内的转移[16]。大量研究证实LncRNA 可以靶向miRNA 对癌症细胞起到调控作用[17]。有研究表明,LINC00491 可通过调控miR-324-5p/ROCK1 抑制肝癌细胞增殖、克隆和迁移,诱导细胞周期停滞和凋亡[18]。本研究通过双荧光素酶报告实验验证BLACAT1 可靶向调节miR-324-5p,通过RT-qPCR检测组织和细胞中基因表达,得出相比于人正常肝细胞,肝癌细胞BLACAT1 表达升高,miR-324-5p表达显著降低,进一步说明了其靶向关系,而敲减BLACAT1 可上调miR-324-5p 表达,且下调miR-324-5p 减弱了敲减BLACAT1 对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。提示敲减BLACAT1 可能通过上调miR-324-5p 抑制Huh-7 细胞增殖、迁移和侵袭能力。

本研究还表明MAP4K3 是miR-324-5p 的靶标,进一步的双荧光素酶实验验证了二者的靶向关系。MAP4K3 是丝裂原激活蛋白激酶的一个上游激活因子,其参与细胞增殖、凋亡、周期调控等多种生物学行为,在多种肿瘤中高表达,加速肿瘤细胞转化[19]。有研究表明,miR-199a-5p 和let-7c 通过靶向MAP4K3 来抑制肝癌细胞的迁移和侵袭[20]。本研究与前人研究趋势相吻合,MAP4K3 mRNA 在肝癌组织及细胞中显著增加,而敲减BLACAT1 可下调MAP4K3 蛋白表达,下调miR-324-5p 减弱了敲减BLACAT1 对MAP4K3 蛋白表达的抑制作用,表明干扰BLACAT1 通过miR-324-5p/MAP4K3 轴抑制Huh-7 细胞恶性生物学行为。然而本研究尚存在不足之处,仅仅在一种细胞水平上验证了BLACAT1/miR-324-5p/MAP4K3 轴对肝癌增殖、迁移和侵袭的影响,并未在多种细胞以及制备荷瘤小鼠在动物体内水平上进行探讨,后续研究将进行更深一步的探索。

综上所述,在肝癌组织以及细胞中,BLACAT1、MAP4K3 表达升高,miR-324-5p 表达降低,敲减BLACAT1 可能通过靶向miR-324-5p 并下调MAP4K3 抑制Huh-7 细胞增殖、迁移和侵袭。BLACAT1/miR-324-5p/MAP4K3 轴可能成为治疗肝癌的一种新的靶点。