lncRNA SNHG6通过microRNA-26b-5p对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的作用机制研究*

卢宏全，黄国定，林影，张诚胜

（1.海南西部中心医院 肿瘤内科，海南 儋州 571700；2.海南西部中心医院 神经内科，海南 儋州 571700；3.海南医学院第二附属医院 肿瘤内科，海南 海口 570311）

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其中三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是恶性程度最高的一种类型，占乳腺癌的15%～20%[1-2]。TNBC具有发展迅速、易复发、预后较差、病死率高的特点。目前TNBC 缺乏特异性治疗靶点，因此了解TNBC 的发生、发展机制，寻找新的治疗靶点对于治疗TNBC 具有重要意义[3]。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一种无编码蛋白功能的RNA，近年来研究发现，lncRNA SNHG6 在转录及转录后水平上能调控基因表达，从而在肿瘤治疗中发挥重要作用[4-5]。本课题组前期发现TNBC 组织与正常组织、TNBC 细胞与正常乳腺上皮细胞的SNHG6表达差异显著，TNBC 组织及细胞中lncRNA SNHG6高表达。且microRNA-26b-5p（miR-26b-5p）在乳腺癌等多种肿瘤细胞中的调控作用已得到证实[6-7]。因此，本文旨在探究lncRNA SNHG6 通过miR-26b-5p 对TNBC 细胞行为学的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞来源

人TNBC 细胞系MDA-MB-231 细胞（上海弘顺生物科技有限公司）。

1.2 主要试剂及仪器

miR-26b-5p 抑制物、SNHG6 敲减的慢病毒载体（南通百奥迈科生物技术有限公司），Lipofectamine 2000 试剂（美国Invitrogen 公司），TRIzol 试剂（上海联硕生物科技有限公司），逆转录试剂盒（美国Promega公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）试剂盒（上海一研生物科技有限公司），CCK-8 试剂盒（上海汉恒生物工程有限公司），基质胶（美国Corning 公司），荧光素酶检测剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）。

二氧化碳培养箱（型号：120300，北京泽平科技有限责任公司），倒置荧光显微镜（型号：DMi8A，上海徕卡显微系统贸易有限公司），生物发光检测仪（型号：lucetta 2，北京泽平科技有限责任公司）。

1.3 细胞培养及分组

将MDA-MB-231 细胞解冻至室温，接种于DMEM 培养基（含10%胎牛血清），置于二氧化碳培养箱中培养，调节CO2浓度为5%，温度为37℃，饱和湿度。取对数生长期的MDA-MB-231 细胞，按1×105个/孔的密度接种于6 孔板上，培养箱中培养24 h，待细胞密度达70%～80%时进行转染。

分别设置对照组、SNHG6 敲减组、miR-26b-5p抑制组、共转染组。对照组采用空载质粒进行转染，SNHG6 敲减组采用si-SNHG6 慢病毒载体进行转染，miR-26b-5p 抑制组采用空载质粒及miR-26b-5p-inhibitor 进行转染，共转染组同时采用si-SNHG6慢病毒载体及miR-26b-5p-inhibitor 进行转染。

1.5 方法

1.5.1 细胞转染转染过程按照Lipofectamine 2000 试剂盒说明书进行操作，参照细胞分组的干预内容进行转染，于二氧化碳培养箱中培养48 h，采用倒置荧光显微镜观察转染效率（绿色荧光检测）[8]。稳定转染：转染效率＞70%。MDA-MB-231 细胞稳定转染后，后续所有实验均设置4 个复孔，各实验重复3 次，并取均值。

1.5.2 qRT-PCR 检测细胞SNHG6、miR-26b-5p mRNA 的表达采用TRIzol 试剂盒提取MDA-MB-231 细胞总RNA，并检测RNA 浓度及纯度，以RNA为模板，采用逆转录试剂盒逆转录得到cRNA，以U6为内参进行qRT-PCR，反应体系共20 μL：cDNA 模板2 μL，SYBR 10 μL，正向、反向引物各1 μL，纯水6 μL。扩增条件：95℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸10 s，共40 次循环[9]。采用2-ΔΔCt法计算SNHG6、miR-26b-5p 相对表达量，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5.3 CCK-8法检测MDA-MB-231细胞增殖能力MDA-MB-231 细胞稳定转染后，将细胞密度调整为2×104个/mL，在96 孔板中，每孔接种0.1 mL 细胞悬液，分别于二氧化碳培养箱中培养24 h、48 h 和72 h，每孔加入0.1 mL CCK-8 溶液，继续培养4 h，采用酶标仪检测450 nm 处光密度（optical density,OD）值，根据OD 值判断细胞增殖能力。

1.5.4 划痕实验检测MDA-MB-231 细胞迁移能力MDA-MB-231 细胞稳定转染后，于6 孔板进行培养，每孔取2×103个细胞，培养过夜使细胞贴壁生长，采用移液枪头于培养孔背后垂直划线，冲洗后继续培养，分别于0 h 与24 h 取出，观察划痕愈合情况，拍照取样后利用Image 软件测量划痕区宽度，计算不同时间的划痕愈合率。划痕愈合率（%）=（d0hd24h）/d0h×100%）[10]

1.5.5 Transwell 实验检测MDA-MB-231 细胞侵袭能力MDA-MB-231 细胞稳定转染后，制成细胞密度为2×104个/mL 的细胞悬液，向Transwell 小室上室加入50 μL 稀释的基质胶，凝固后加入100 μL 细胞悬液，下室加入500 mL DMEM 培养基（含10%胎牛血清），二氧化碳培养箱中培养48 h 后，移去培养液，轻轻擦去上室剩余细胞，4%多聚甲醛固定后，加入0.1%结晶紫染色，15 min 后显微镜下观察，记录紫色细胞数，随机取3 个视野的均值[11]。

1.5.6 双荧光素酶报告实验验证SNHG6 与miR-26b-5p 的靶向作用将SNHG6基因插入到荧光素酶基因上游，构建SNHG6-Wt（野生型）、SNHG6-Mut（突变型）的双荧光素酶报告质粒，采用miR-26b-5p-mimics-NC 质粒及miR-26b-5p-mimics 质粒，与SNHG6-Wt、SNHG6-Mut 共转染MDA-MB-231 细胞，最终得到 miR-26b-5p-mimics-NC-SNHG6-Wt、miR-26b-5p-mimics-NC-SNHG6-Mut、miR-26b-5pmimics-SNHG6-Wt、miR-26b-5p-mimics-SNHG6-Mut，4 种细胞，并分为4 组。转染后培养48 h，裂解细胞并离心，收集上清液，分别向上清液中加入反应液及终止液各50 μL，最终采用生物发光检测仪检测荧光素酶活性[12]。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞SNHG6、miR-26b-5p mRNA 相对表达量比较

对照组、SNHG6 敲减组、miR-26b-5p 抑制组、共转染组SNHG6 和miR-26b-5p mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与对照组比较，SNHG6 敲减组SNHG6 mRNA 表达下调（P＜0.05），miR-26b-5p mRNA 表达上调（P＜0.05）；与对照组比较，miR-26b-5p 抑制组SNHG6 mRNA 表达上调（P＜0.05），miR-26b-5p mRNA 表达下调（P＜0.05）；与SNHG6 敲减组比较，miR-26b-5p 抑制组和共转染组SNHG6 mRNA表达上调（P＜0.05），miR-26b-5p mRNA 表达下调（P＜0.05）；与miR-26b-5p 抑制组比较，共转染组SNHG6 mRNA 表达下调（P＜0.05），miR-26b-5p mRNA 表达上调（P＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞SNHG6、miR-26b-5p mRNA相对表达量比较 （±s）

表2 各组细胞SNHG6、miR-26b-5p mRNA相对表达量比较 （±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与SNHG6 敲减组比较，P＜0.05；③与miR-26b-5p抑制组比较，P＜0.05。

miR-26b-5p mRNA 1.00±0.01 3.26±0.34①0.73±0.07①②1.42±0.15①②③145.535 0.000组别对照组SNHG6敲减组miR-26b-5p抑制组共转染组F 值P 值SNHG6 mRNA 1.00±0.01 0.68±0.07①1.72±0.20①②1.15±0.16②③42.884 0.000

2.2 各组MDA-MB-231细胞增殖情况比较

对照组、SNHG6 敲减组、miR-26b-5p 抑制组、共转染组24 h、48 h、72 h 的OD 值比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点OD 值有差异（F=52.481，P=0.000）。②4 组OD 值有差异（F=50.336，P=0.000），与对照组比较，SNHG6 敲减组及共转染组24 h、48 h 及72 h 的OD 值降低（P＜0.05），miR-26b-5p 抑制组24 h、48 h 及72 h 的OD 值升高（P＜0.05）；与SNHG6 敲减组比较，miR-26b-5p 抑制组和共转染组24 h、48 h 及72 h 的OD 值升高（P＜0.05）；与miR-26b-5p 抑制组比较，共转染组OD 值降低（P＜0.05）。③4 组OD 值变化趋势有差异（F=20.109，P=0.000）。见表3。

表3 各组不同时间点MDA-MB-231细胞OD值比较 （±s）

表3 各组不同时间点MDA-MB-231细胞OD值比较 （±s）

注：①与24 h比较，P＜0.05；②与48 h比较，P＜0.05；③与对照组比较，P＜0.05；④与SNHG6敲减组比较，P＜0.05；⑤与miR-26b-5p抑制组比较，P＜0.05。

72 h 0.68±0.07①②0.32±0.04①③0.84±0.09①②③④0.44±0.05①③④⑤组别对照组SNHG6敲减组miR-26b-5p抑制组共转染组24 h 0.41±0.05 0.15±0.02③0.58±0.08③④0.27±0.04③④⑤48 h 0.57±0.06①0.27±0.03①③0.71±0.07①③④0.38±0.04①③④⑤

2.3 各组MDA-MB-231细胞迁移情况比较

对照组、SNHG6 敲减组、miR-26b-5p 抑制组、共转染组划痕愈合率分别为（29.20±3.81）%、（11.61±2.04）%、（52.18±6.25）%和（16.73±3.11）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=79.321，P=0.000）。进一步两两比较结果：与对照组比较，SNHG6 敲减组和共转染组划痕愈合率降低（P＜0.05），miR-26b-5p抑制组划痕愈合率升高（P＜0.05）；与SNHG6 敲减组比较，miR-26b-5p 抑制组和共转染组划痕愈合率升高（P＜0.05）；与miR-26b-5p 抑制组比较，共转染组划痕愈合率降低（P＜0.05）。见图1。

图1 各组MDA-MB-231细胞迁移图

2.4 各组MDA-MB-231细胞侵袭情况比较

对照组、SNHG6 敲减组、miR-26b-5p 抑制组、共转染组侵袭细胞数分别为（78.18±8.41）个/HP、（31.84±4.66） 个/HP、（108.38±11.05） 个/HP 和（49.61±5.38）个/HP，经方差分析，差异有统计学意义（F=73.945，P=0.000）。进一步两两比较结果：与对照组比较，SNHG6 敲减组及共转染组侵袭细胞数减少（P＜0.05），miR-26b-5p 抑制组侵袭细胞数增加（P＜0.05）；与SNHG6 敲减组比较，miR-26b-5p 抑制组和共转染组侵袭细胞数增加（P＜0.05）；与miR-26b-5p 抑制组比较，共转染组侵袭细胞数减少（P＜0.05）。见图2。

图2 各组MDA-MB-231细胞侵袭情况 （0.1%结晶紫染色×400）

2.5 双荧光素酶实验结果

miR-26b-5p-mimics-NC-SNHG6-Wt 组、miR-26b-5p-mimics-SNHG6-Wt 组荧光素酶活性分别为（1.01±0.07）和（0.41±0.10），经t检验，差异有统计学意义（t=59.445，P=0.000），miR-26b-5p-mimics-SNHG6-Wt 组荧光素酶活性降低。miR-26b-5pmimics-NC-SNHG6-Mut 组、miR-26b-5p-mimics-SNHG6-Mut 组荧光素酶活性分别为（0.95±0.05）和（1.04±0.08），经t检验，差异无统计学意义（t=6.843，P=0.076）。见图3。

图3 miR-26b-5p与SNHG6的靶向关系

3 讨论

TNBC 是一种恶性程度较高的恶性肿瘤，具有发病急、预后差、病死率高的特点，其病因复杂，与性激素环境、生活方式等有一定关系[13]。目前临床主要以化疗或靶向治疗为主，化疗需要长期治疗，副作用明显且疗效有限，而TNBC 缺乏治疗靶点，因此寻找TNBC 新的治疗靶点成为研究的热点[14-15]。SNHG6 在结直肠癌、肺癌及胶质瘤等癌症中异常表达，且有研究显示，SNHG6 高表达与癌症患者的预后密切相关[16-17]。赵焱等[18]研究显示，SNHG6 在舌癌组织中高表达，敲减舌癌细胞中SNHG6 表达能够抑制Tca1183 舌癌细胞增殖，并促进细胞凋亡。因此推测SNHG6 对TNBC 细胞的增殖、迁移等具有一定的影响。本课题前期基础研究发现，在多数microRNA 中，干扰SNHG6 对hsa-miR-26b-5p 的影响最明显，因此本文旨在探究SNHG6 通过miR-26b-5p 调控TNBC 的作用机制。

miR-26b-5p 在癌细胞中一般发挥抑癌基因的作用，在卵巢癌、胰腺癌及甲状腺乳头状癌中，对癌细胞的生物学行为均发挥一定的调控作用，影响癌症的发展[19-21]。本研究经过前期基础实验得知，SNHG6 在MDA-MB-231 细胞中同样高表达，但抑制SNHG6 的表达对调控miR-26b-5p，影响MDA-MB-231 细胞的生物学行为尚不清楚。lncRNA 与miRRNA 存在某种靶向关系，能够影响癌细胞的生物学行为。昝玲玲等[22]研究显示，抑制miR-30-5p 的表达，能够逆转下调SNHG6 对乳腺癌MCF-7 细胞的增殖、迁移及侵袭的抑制作用。在张明宝[23]的研究中，lncRNA SNHG5 能够靶向调控下游靶点miR-132-3p，从而促进结直肠癌细胞的增殖、转移和迁徙，抑制结直肠癌细胞的凋亡。本研究在前期基础实验中发现，干扰SNHG6 对hsa-miR-26b-5p 的影响最大，因此通过敲减SNHG6，分析对miR-26b-5p 调控作用，以及对TNBC 细胞生物学行为的影响。本研究结果显示，敲减SNHG6 能够降低OD 值、划痕愈合率及细胞侵袭细胞数，抑制miR-26b-5p 能够增加OD 值、划痕愈合率及细胞侵袭细胞数，而敲减SNHG6 的同时抑制miR-26b-5p 能够进一步降低OD值、划痕愈合率及细胞侵袭细胞数，表明敲减SNHG6 能够抑制MDA-MB-231 细胞的增殖、迁移及侵袭能力，从而延缓TNBC 的发展，且进一步证实miR-26b-5p 同样具有抑制TNBC 细胞增殖、迁移、侵袭的能力。另外，本研究通过双荧光素酶实验及qRT-PCR 检测进一步证实，SNHG6 与miR-26b-5p 基因序列上存在结合位点，SNHG6 低表达能够靶向调控miR-26b-5p 表达升高，抑制MDA-MB-231 细胞的生物学行为；而抑制miR-26b-5p 表达能够影响SNHG6 的表达，从而促进MDA-MB-231 细胞的生物学行为。因此，在敲减SNHG6 及抑制miR-26b-5p 表达的双重作用下，抑制miR-26b-5p 表达能够抵消掉部分敲减SNHG6 对上调miR-26b-5p 表达的促进作用，从而影响MDA-MB-231 细胞的增殖、迁移及侵袭能力。

综上所述，敲减SNHG6 通过靶向上调MDAMB-231 细胞中miR-26b-5p 的表达，抑制TNBC 增殖、迁移及侵袭，为TNBC 新的治疗靶点提供新的研究方向。本文仅通过敲减SNHG6，探究SNHG6 通过miR-26b-5p 调节TNBC 的作用，未来可期通过SNHG6 过表达或miR-26b-5p 过表达，进一步研究SNHG6 对miR-26b-5p 的靶向调控作用，为TNBC 的靶向治疗提供更为科学、严谨的实验研究支持。