Circular RNA LPAR3 通过miR-143-5p/USP14 通路调控食管癌细胞糖酵解的研究

查建栋,徐志渊,陈文琦

香港大学深圳医院 广东省深圳市,518053

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康。食管癌在全球癌症相关死亡原因中排名第6[1-2],患者5 年总生存率仅为20 %～40 %[3]。由于肿瘤细胞具有很强的增殖、侵袭和转移能力,需要高能量代谢来提供所需的能量。随着肿瘤体积的增加,肿瘤不可避免地会出现缺氧状态。因此,肿瘤细胞有其特定的细胞代谢机制,即以糖酵解为主的代谢模式[3-5]。如果能有效抑制癌症细胞的糖酵解途径,就可以有效地控制肿瘤进展。

环状RNA (CircRNA) 来源于前体微小RNA(microRNA,mRNA) 转录物的反向剪接,是一类新型的非编码内源性RNA,具有独特的单链闭环,缺乏5′-3′极性和多腺苷酸化尾[6-7]。由于下一代测序和生物信息学方法的发展,已经鉴定出更多功能的CircRNA[8]。越来越多的研究表明,CircRNAs参与许多生物学过程,如增殖、凋亡和迁移,并参与各种癌症的发生和发展[9-11]。

而miRNAs 也是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子,参与转录后基因表达的调控[12]。研究表明,CircRNA 可以调控miRNAs 来调节肿瘤中的下游基因[6,13]。环状RNA 溶血磷脂酸受体(circular RNA lysophosphatidic acid receptor 3,CircLPAR3) 在口腔鳞状细胞癌中抑制肿瘤进展和糖酵解[14];CircUBE2Q2 通过调节细胞自噬和糖酵解促进胃癌的恶性进展[15];Circ-FOXM1 通过调节miR-143-3p/FLOT2 轴来抑制黑色素瘤的细胞凋亡,同时促进细胞增殖、侵袭和糖酵解等[16],表明CircRNA 可以通过调控miRNA来调节癌症细胞的增殖、凋亡和糖酵解途径存在紧密的联系。

去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUB)是泛素依赖性蛋白质降解途径的关键成分,调节许多代谢过程,包括细胞生长、分化和细胞凋亡[17]。泛素特异性蛋白酶14 (ubiquitin-specific protease 14,USP14) 是蛋白酶体的主要调节剂,也是3 种蛋白酶体相关的DUB 之一[18]。同时有研究表明USP14 乳腺癌糖酵解存在紧密联系[19]。故我们推测USP14 在食管癌中的作用可能与糖酵解途径相关,同时认为食管癌细胞糖酵解可能受到Circular RNA LPAR3/miR-143-5p/USP14 通路的调控。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与分组

正常人食管上皮细胞(normal human esophageal epithelial cells,Het-1A) 和食管癌细胞系(包括TE-10、KYSE150 和TE-1 细胞),购自Procell (中国武汉)。食管癌细胞系(KYSE450) 获自Cobioer Bioscience (中国南京)。使用含有10 %胎牛血清(FBS;Gibco,USA) 和1 %青霉素/链霉素(Phygene,Fzhou,China) 的Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640;Biosun,Shanghai,China)培养基,在37 ℃和5 % CO2的潮湿环境中培养。

细胞分组如下: Het-1A (不经任何处理的正常人食管上皮细胞组);TE-10 组(不经任何处理的食管癌细胞系TE-10);KYSE150 组(不经任何处理的食管癌细胞系KYSE150);TE-1 组(不经任何处理的食管癌细胞系TE-1);KYSE450 组(不经任何处理的食管癌细胞系KYSE450);si-NC 组(将si-CircLPAR3-NC 转染至KYSE450 细胞内);si-CircLPAR3 组(将si-CircLPAR3 转染至KYSE450细胞内);si-CircLPAR3 +NC 组(将si-CircLPAR3与inhibit NC 转染至KYSE450 细胞内);CircLPAR3 +inhi 组(将si-CircLPAR3 与miR-143-5p inhibit 转染至KYSE450 细胞内)。其中靶向CircLPAR3 的siRNA 由RiboBio (中国广州) 设计合成,miR-143-5p 模拟物和相应的对照序列由GenePharma 设计和合成。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 进行细胞转染,48 h 后用于后续实验。

1.2 qRT-PCR 分析

根据制造商的说明,使用TRIzol 试剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA) 提取总RNA。使用NanoDrop-1000 (Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA) 测量RNA 浓度。然后根据制造商的建议进行cDNA 合成。简而言之,使用ReverAid First Strand cDNA 试剂盒(Thermo Fisher Scientific) 结合CircLPAR3、miR-143-5p 和USP14的引物对RNA 进行逆转录(RT)。GAPDH 用于标准化circRNA 和线性mRNA 的相对表达水平,而U6 用于标准化miRNA 表达水平。逆转录反应后,使用LightCycler 480 SYBR-Green I Master 和Light-Cycler 480 实时PCR 系统(均来自Roche Applied Science) 检 测CircLPAR3、miR-143-5p 和USP14 mRNA 的表达。CircLPAR3、miR-143-5p 和USP14的相对表达量由2-ΔΔCt法计算所得。相关引物序列皆由上海英拜生物科技有限公司设计合成。引物序列如表1 所示。

表1 qRT-PCR 中所用引物序列

1.3 细胞外酸化率(ECAR) 和耗氧率(OCR) 测定

参见文献[20] 的方法,使用Seahorse XF 24细胞外通量分析仪(Seahorse Bioscience) 测量细胞外酸化率(ECAR) 和耗氧率 (OCR)。ECAR和OCR 分别使用Seahorse XF 糖酵解压力测试试剂盒和Seahorse XF 细胞线粒体压力测试试剂盒(Agilent Technologies) 进行测量。

1.4 蛋白质印迹分析

使用RIPA 裂解缓冲液匀浆来自细胞的总蛋白质。并且通过BCA 蛋白质试剂 (Sangon Biotech Co.,Ltd.,China,Shanghai) 测定蛋白质浓度。参见文献[21] 的方法进行蛋白质印迹分析。一抗为人HK2 (己糖激酶Ⅱ) 敲除HCT116 细胞系(ab273721,Abcam,USA,1∶1 000);二抗为抗己糖激酶Ⅱ抗体 (ab209847,Abcam,UK,1 ∶20 000)。抗β-肌动蛋白抗体用作内参。使用Bio-Rad 数码图像系统拍照并保存分析图片,采用Image J 软件(National Institutes of Health,Bethesda,Maryland,USA) 对目的条带进行灰度值分析。

1.5 荧光素酶报告基因测定

CircLPAR3 的野生型(Wild type,WT) 和突变型(Mutant type,MUT) 质粒以及USP14 的3′-非翻译区(3′UTR) 由上海英拜生物科技有限公司设计合成,分别将其命名为CircLPAR3-WT,CircLPAR3-MUT,USP14-3′UTR-WT 和USP14-3′UTRMUT。野生型报告质粒包含miR-143-5p 的结合位点,而突变型报告质粒不包含与miR-143-5p 的结合位点。然后,根据上述方法,将上述质粒转染到具有miR-143-5p 模拟物或模拟物对照的KYSE150细胞中。孵育48 h 后,使用Dual-Lucy Assay Kit(Solarbio) 检测荧光素酶活性。

1.6 统计学分析

本研究数据使用SPSS 21.0 (SPSS,Inc,Chicago,IL,USA) 和GraphPad Prism 8.01 (Graph-Pad Software Inc) 统计学软件对数据进行统计分析和作图。连续变量的正态分布采用Kolmogorov-SmiRnov 验证,数据以平均值±标准差表示,组间数据比较采用t检验或者One-way ANOVA,事后检验采用Tukey’s multiple comparisons test。

2 结果

2.1 CircLPAR3 在食管癌细胞中高表达

为了确定CircLPAR3 与食管癌进展的关联,我们首先通过qRT-PCR 法分析了CircLPAR3 在正常食管细胞Het-1A 与食管癌细胞TE-10、KYSE150、TE-1 和KYSE450 中的表达。结果表明,与Het-1A组比较,TE-10、KYSE150、TE-1 和KYSE450 组中的CircLPAR3 显著高表达(P均＜0.05,图1A),同时qRT-PCR 的结果显示,在所选择的4 种食管癌细胞中,KYSE450 中CircLPAR3 的表达显著高于其他3 组(P均＜0.05,图1B)。

表明KYSE450 细胞系与正常食管细胞Het-1A的CircLPAR3 表达差异较大,可以用于进行后续的相关实验。

2.2 抑制CircLPAR3 的表达能抑制食管癌细胞的糖酵解

随后我们通过抑制CircLPAR3 表达以分析对KYSE150 细胞糖酵解行为的相应影响。首先通过qRT-PCR 的结果确定了CircLPAR3 表达成功被抑制(图2A)。随后细胞外通量分析仪的分析结果与WB 的检测结果显示,与Het-1A 组比较,KYSE450 组中的关键糖酵解酶HK2 的蛋白表达水平增加,同时细胞外酸化率(ECAR) 增加,整体糖酵解耗氧率(OCR) 减少(图2B、C、D,P均＜0.05),表明在食管癌细胞促进了糖酵解途径。在成功抑制CircLPAR3 的表达后,与si-NC 组比较,si-CircLPAR3 组中的关键糖酵解酶HK2 的蛋白表达水平降低,同时细胞外酸化率(ECAR) 减少,整体糖酵解耗氧率(OCR) 增加(图2B、C、D,P均＜0.05),表明抑制CircLPAR3 的表达能抑制食管癌细胞的糖酵解途径。

图2 CircLPAR3 在食管癌细胞中高表达

2.3 miR-143-5p 是CircLPAR3 的靶基因

为了进一步探究CircLPAR3 与miR-143-5p 的关系,首先通过starbase 在线数据库 (http://starbase.sysu.edu.cn/) 预测 CircLPAR3 与 miR-143-5p 之间的结合位点(图3A)。随后通过双荧光素酶测定进行验证,结果表明: 与共转染mimics-NC 和CircLPAR3-WT 的KYSE450 细胞比较,共转染 mimics-miR-143-5p 和 CircLPAR3-WT 的KYSE450 细胞荧光素酶活性降低(P＜0.01),而用CircLPAR3-MUT 转染的软骨细胞中荧光素酶活性没有显着变化(图3B)。同时,qRT-PCR 的结果表明,与Het-1A 组比较,KYSE450 组中的miR-143-5p 显著低表达;与si-NC 组比较,si-CircLPAR3 组的miR-143-5p 表达显著升高,表明在抑制CircLPAR3 的表达调控了miR-143-5p 的表达(图3C)。

图3 miR-143-5p 是CircLPAR3 的靶基因

上述结果表明,miR-143-5p 是CircLPAR3 的靶基因。

2.4 CircLPAR3 通过调控miR-143-5p 抑制食管癌细胞的糖酵解

在明确了CircLPAR3 与miR-143-5p 的靶向关系后,为探索CircLPAR3 是否通过miR-143-5p 来抑制食管癌细胞的糖酵解,我们首先通过qRTPCR 的结果确定了miR-143-5p 成功在KYSE450 完成了过表达(图4A);随后细胞外通量分析仪的分析结果与WB 的检测结果显示,与si-CircLPAR3+NC组比较,si-CircLPAR3+inhi 组的关键糖酵解酶HK2 的蛋白表达水平增加,同时细胞外酸化率(ECAR) 增加,整体糖酵解耗氧率(OCR) 减少(图4B、C、D,P均＜0.05)。上述结果表明,CircLPAR3 通过调控miR-143-5p 抑制食管癌细胞的糖酵解。

图4 CircLPAR3 通过调控miR-143-5p 抑制食管癌细胞的糖酵解

2.5 miR-143-5p 靶向抑制USP14

对miR-143-5p 调节糖酵解途径的下游靶基因进行了研究。使用targetscan 在线数据库 (http://www.targetscan.org/vert_ 71/) 预测USP14与miR-143-5p 之间的结合位点。随后通过双荧光素酶测定进行验证,结果表明:

与共转染mimics-NC 和USP14-WT 的KYSE450细胞比较,共转染mimics-miR-143-5p 和USP14-WT的KYSE450 细胞荧光素酶活性降低(P＜0.01),而用USP14-MUT 转染的软骨细胞中荧光素酶活性没有显着变化(图5B)。同时,qRT-PCR 的结果表明,与Het-1A 组比较,KYSE450 组中的USP14显著高表达;与si-NC 组比较,si-CircLPAR3 组的USP14 表达显著降低,表明在抑制CircLPAR3 的表达后,miR-143-5p 的高表达抑制了USP14 的表达;与si-CircLPAR3+NC 组比较,si-CircLPAR3+inhi组的的USP14 表达显著升高,说明抑制了miR-143-5p 的表达后促进了USP14 的表达(图5C,P均＜0.05)。上述结果表明,miR-143-5p 靶向抑制USP14。

图5 miR-143-5p 靶向抑制USP14

3 讨论

近年来,CircRNAs 已成为仅次于miRNA 和长链非编码RNA 的疾病相关研究热点。越来越多的学者开始研究CircRNA 在肿瘤中的作用,包括食管癌[22]。然而,很少有研究关注食管癌中CircRNA 的表达和功能。本研究探索了CircLPAR3 在食管癌中的可能机制,即与糖酵解相关的机制。

我们发现CircLPAR3 在不同食管癌细胞系中的表达明显高于正常食管细胞,同时发现在KYSE450 细胞系中的表达最高。我们进一步证实了食管癌细胞中 CircLPAR3 的表达会影响KYSE450 细胞的糖酵解途径。在KYSE450 细胞中,糖酵解途径被激活,而抑制CircLPAR3 的表达后,KYSE450 细胞的糖酵解途径受到了抑制,说明CircLPAR3 能够调控食管癌细胞的糖酵解途径。据我们所知,这项研究首次报道了CircLPAR3 在食管癌细胞中对糖酵解途径的作用。

CircRNA 可分为外显子CircRNA、内含子CircRNA、外显子-内含子CircRNA (EIciRNA) 和基因间CircRNA[23]。其中,外显子CircRNA 主要位于细胞质中,是体内最丰富的CircRNA[24]。最近的研究表明,CircRNA 分子中富含miRNA 反应元件,可以与miRNA 竞争性结合,在细胞中发挥miRNA 海绵的作用,解除miRNA 对其靶基因的抑制,上调靶基因的表达[25]。本研究通过生物信息学分析预测、qRT-PCR 和荧光素酶测定验证了CircRNA LPAR3 可靶向调控miR-143-5p。

大量报道表明,miR-143 在多种癌细胞中表达下调,包括结直肠癌、鼻咽癌、肺癌和B 细胞恶性肿瘤[26-27]。同时有研究报道,miR-143 通过抑制糖酵解参与内皮细胞功能障碍;miR-143-3p/miR-155-5p 通过调节多囊卵巢综合征颗粒细胞的糖酵解来调节卵泡发育不良[28];LncRNA-SARCC 通过靶向己糖激酶2 的miR-143 介导的糖酵解抑制,使骨肉瘤对顺铂敏感,这与我们的发现一致,miR-143-5p 能够影响食管癌细胞的糖酵解途径,且受到CircRNA LPAR3 的调控。随后我们还确定了miR-143-5p 能够靶向调控USP14 的表达,而miR-143-5p 是否通过靶向调控USP14 来影响食管癌细胞的糖酵解途径尚不明确,我们也将在后续进行深入研究。

总之,我们报告在食管癌细胞中CircRNA LPAR3 高表达,miR-143-5p 低表达。此外,调节CircRNA LPAR3 和miR-143-5p 的表达情况均能够影响到食管癌细胞的糖酵解途径。这项研究为CircRNA LPAR3 和miR-143-5p 在食管鳞状细胞癌发展中的抗癌机制提供了一个有力证据。而其下游机制仍有待确定。这些结果表明,CircRNA LPAR3和miR-143-5p 最终可能构成食管癌细胞的有用生物标志物以及治疗靶点。