复方守宫散通过TNF-α 信号通路对骨癌痛大鼠痛觉敏化机制的研究

蔡琪 ,张良军 ,黄璟 ,毛汉文 ,田敬海 ,夏黎明

1安徽医科大学第一临床学院 合肥市,230037 武汉市东西湖区人民医院2肿瘤科,3骨外科 武汉市,430040 4安徽医科大学第一附属医院肿瘤科 合肥市,230031

疼痛是癌症患者的常见症状,研究表明85 %的乳腺癌、肺癌、前列腺癌患者出现骨转移,而骨转移可以引起高钙血症、脊髓压迫、骨癌痛等症状,其中约三分之一患者伴有骨癌痛[1-2]。骨癌痛包括神经性疼痛和炎症性疼痛,显著降低患者的生活质量,缩短了生存期[3]。骨癌痛产生疼痛难以忍受,但目前的治疗策略可能存在不足亦或产生副作用[4],因此迫切需要开发新的治疗药物、探索新的机制缓解骨癌痛。中医学认为骨癌痛属于“骨疽”、“骨蚀”、“骨瘤” 等范畴,是由机体寒瘀、痰阻、本虚、气滞等导致。中草药复方守宫散(Compound Shougong powder,CSP) 属于一种复方药,包括守宫、制何首乌、三七、梅花、生晒参、没药,具有消肿止痛、补虚解毒等功效,可用于多种癌症如肺癌的治疗[5],另外研究发现CSP 对S180 荷瘤小鼠具有显著镇痛作用[6],但对于肺癌骨癌痛的治疗鲜有报道。研究发现炎性反应可能在慢性疼痛进展中起重要作用[7]。其中肿瘤坏死因子α (tumour necrosis factor α,TNF-α) 是一种炎性介质,不仅介导炎症进展,还参与神经性疼痛的调节[8]。研究表明TNF-α 通过钙、钾、钠离子通道调节伤害性神经元的敏感性,可能与疼痛通路密切相关[9],基于以上报道推测TNF-α 通路可能通过影响炎性因子水平及行为学变化,参与肺癌骨癌痛的发展。因此本研究通过建立肺癌骨癌痛大鼠模型,通过检测其行为学 [机械性缩足反射阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)、热痛觉缩足潜伏期(paw withdrawal thermal lathency,PWTL)] 变化及炎性因子[TNF-α、白介素(interleukin,IL) -1β、IL-6] 变化,探讨CSP 对肺癌骨癌痛大鼠痛觉敏化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞来源 ATCC 提供Lewis 肺癌细胞株(目录号: TCM7)。深圳市疾病预防控制中心提供雌性,SPF 级SD 大鼠72 只,4 周龄,体质量115～123 g,动物许可证号: SYXK (粤)2022-0282。所有大鼠均饲养于SPF 级动物房中,自由进食、饮水。该研究已获得动物伦理使用委员会的批准。

1.1.2 实验试剂与仪器 安徽中医药大学第一附属医院提供CSP;GIBCO 公司提供DMEM 培养基(货号: 12100046);美国BD 公司提供注射器;Sigma 公司提供PVDF 膜、戊巴比妥钠 (货号:SIGMA-P3761);碧云天生物技术有限公司提供BCA 蛋白检测试剂盒;Bio-Rad 公司提供SDSPAGE 凝胶;Thermo Fisher Scientific 公司提供RIPA缓冲液;上海酶联生物科技有限公司提供TNF-α(货号: 002859)、IL-1β (货号: 037361)、IL-6(货号: 064292) ELISA 试剂盒;Abcam 公司提供单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein-1,MCP-1) (货号: ab7202)、TNF-α (货号: 109322)一抗。

中国医学科学院生物医学工程研究所提供全自动热痛测试仪(BME-410C 型);日本NIKON 株式会社提供倒置显微镜(MA100)。

1.2 方法

1.2.1 肺癌骨癌痛大鼠模型的制备及干预 参照文献[10]建立肺癌骨癌痛大鼠模型: 随机选取2只大鼠使用40 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,采用仰卧位固定大鼠,酒精消毒大鼠右腋部皮下,将Lewis 肺癌细胞[ (对数期,2 ×107个/mL 悬液(0.5 mL)] 皮下接种于该部位,在标准条件下继续饲养。两周后,麻醉并处死已成皮下瘤的5 只大鼠,无菌环境下取肿瘤组织,生理盐水研磨制备细胞悬液,调整细胞浓度(2 ×108个/mL)。将剩余60 只大鼠分为造模组 (50 只)、假手术组 (10只),40 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,在左侧膝关节胫骨处利用规格为1 mL 注射器进行3～4 mm 的穿刺钻孔,然后改用25 μL 微量进样器吸取1 μL 空气、1 μL 明胶水溶液以及10 μL 肿瘤细胞悬液(使用PBS 悬浮) 进行注射,缓慢去针,无菌棉签蘸生理盐水清洗伤口,其中假手术组仅注射PBS 溶液。造模完成第7 天,大鼠缩足反应明显增多,表明肺癌骨癌痛大鼠造模成功[11]。将造模组大鼠随机分为模型组、阳性对照(扶他林)组、CSP 低(CSP-L)、中(CSP-M)、高(CSP-H)剂量组,其中CSP-H、CSP-M、CSP-L 分别以80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg CSP 灌胃干预[12];阳性对照组以扶他林局部用药0.1 g/kg 干预[13],假手术组、模型组以生理盐水干预;每天干预一次,连续3 周。

1.2.2 检测大鼠PWMT 采用Von Frey 纤维测定PWMT,具体操作如下: 将大鼠提前放入有机玻璃格子适应30 min,以大鼠左后肢足底中心为作用点,依次使用Von Frey 细丝刺激该部位,当大鼠出现舔足、抬足行为标记为阳性反应。PWMT 的记录标准: 每个强度进行10 次检测,当有5 次阳性反应时,记下该数值,再重复3 次,取平均值即为PWMT。各组大鼠分别在用药前、后进行PWMT 检测。

1.2.3 检测大鼠PWTL 采用全自动热痛测试仪测定PWTL,将大鼠提前放入有机玻璃格子适应30 min,以大鼠左侧后肢足部中心为热辐射刺激仪的聚焦作用点,当大鼠出现回缩、抬起行为记为阳性,PWTL 即是大鼠从被照射(光照强度调节为75 %) 直至出现阳性行为时的作用时间。每只大鼠重复3 次,间隔时间为10 min,为防止损伤大鼠组织,每次作用时间不得超过20 s。各组大鼠分别在用药前、后进行检测PWTL。

1.2.4 ELISA 检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平变化 PWMT、PWTL 检测结束后,40 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,腹部主动脉取血,离心后取上清液,按照ELISA 试剂盒说明书进行检测TNF-α、IL-1β、IL-6 水平。

1.2.5 Western 印迹检测脊髓组织中MCP-1、TNFα 蛋白表达 处死各组大鼠,分离腰椎脊髓(L3～L5) 组织,采用RIPA 缓冲液、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂的混合物裂解10 min,在4 ℃以11 500 r/min 离心5 min,收集上清液,并进行BCA 测定以确定总蛋白浓度;在10 % SDS-PAGE 凝胶上电泳分离蛋白质并转移到PVDF 膜,然后将免疫印迹在溶解于脱脂牛奶中孵育2 h,在4 ℃下与MCP-1、TNF-α、βactin 一抗孵育过夜,次日洗膜后,再与二抗在室温下孵育1 h,使用Thermo Chemical 发光免疫分析仪检测蛋白质,Image J 软件分析蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CSP 对各组大鼠机械性缩足反射阈值(PWMT) 的影响

用药前,模型大鼠PWMT 较假手术组均显著降低(P＜0.05);用药后,与假手术组比较,模型组PWMT 显著降低(P＜0.05);与模型组比较,阳性对照组和CSP-L 组、CSP-M 组、CSP-H 组PWMT 显著升高(P＜0.05);阳性对照组PWMT与CSP-H 组差异无统计学意义(P＞0.05,表1)。

表1 各组大鼠PWMT 的比较(,n=10)

表1 各组大鼠PWMT 的比较(,n=10)

PWMT: 机械性缩足反射阈值。与假手术组比较,aP＜0.05;与模型组比较,b P＜0.05;与CSP-L 组比较,c P＜0.05;与CSP-M 组比较,dP＜0.05

2.2 CSP 对各组大鼠热痛觉缩足潜伏期(PWTL) 的影响

用药前,模型大鼠PWTL 较假手术组均显著缩短(P＜0.05);用药后,与假手术组比较,模型组PWTL 显著缩短(P＜0.05);与模型组比较,阳性对照组和CSP-L 组、CSP-M 组、CSP-H 组PWTL显著延长(P＜0.05);阳性对照组用药后PWTL 与CSP-H 组差异无统计学意义(P＞0.05,表2)。

表2 各组大鼠PWTL 的比较(,n=10)

表2 各组大鼠PWTL 的比较(,n=10)

PWTL: 热痛觉缩足潜伏期。与假手术组比较,a P ＜0.05;与模型组比较,b P＜0.05;与CSP-L 组比较,c P＜0.05;与CSP-M 组比较,dP＜0.05

2.3 CSP 对各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的影响

与假手术组比较,模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平显著升高(P＜0.05);与模型组比较,阳性对照组和CSP-L 组、CSP-M 组、CSP-H组TNF-α、IL-1β、IL-6 水平显著降低(P＜0.05);阳性对照组TNF-α、IL-1β、IL-6 水平与CSP-H 组差异均无统计学意义(P＞0.05,表3)。

表3 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的比较(,n=10,ng/L)

表3 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的比较(,n=10,ng/L)

与假手术组比较,aP＜0.05;与模型组比较,bP＜0.05;与CSP-L 组比较,cP＜0.05;与CSP-M 组比较,dP＜0.05

2.4 CSP 对各组大鼠脊髓组织MCP-1、TNF-α 蛋白表达水平的影响

与假手术组比较,模型组大鼠脊髓组织中MCP-1、TNF-α 表达水平显著升高(P＜0.05);与模型组比较,阳性对照组和CSP-L 组、CSP-M 组、CSP-H 组MCP-1、TNF-α 表达水平显著降低(P＜0.05);阳性对照组MCP-1、TNF-α 表达水平与CSP-H 组差异均无统计学意义(P＞0.05,图1、表4)。

图1 各组大鼠脊髓组织中MCP-1、TNF-α 表达(Western 印迹图)

表4 各组大鼠脊髓组织中MCP-1、TNF-α表达的比较(,n=10)

表4 各组大鼠脊髓组织中MCP-1、TNF-α表达的比较(,n=10)

与假手术组比较,a P＜0.05;与模型组比较,b P＜0.05;与CSP-L 组比较,cP＜0.05;与CSP-M 组比较,dP＜0.05

3 讨论

研究发现70 %的晚期癌症患者会经历癌症疼痛,超过80 %的疼痛归因于转移性癌症引起的骨癌疼痛,但其机制较为复杂,涉及外周、中枢神经系统受损、破骨细胞的过度活化[14]。虽然双膦酸盐、阿片类药物、非甾体类抗炎药等可缓解许多骨癌痛患者的疼痛,但常伴随不良副作用的发生,例如胃出血[15]。因此迫切需要新的药物治疗骨癌痛。本研究通过注射Lewis 肺癌细胞建立肺癌骨癌痛大鼠模型,当大鼠出现明显的缩足反应时,表明肺癌骨癌痛大鼠模型建立成功,可用于新药及机制的研究。

据《清代外科证治全书》 记载“贴骨瘤,贴骨而生,极疼痛”,在中医看来骨癌痛属于“不通则痛”、“不荣则痛”,所以大多数中药治疗多以补肾健骨、活血化瘀为主[16]。如在Lewis 肺癌引起的小鼠骨痛研究中,木犀草素可以抑制脊髓背侧神经元、神经胶质细胞和NOD 样受体蛋白3 炎性小体的激活,进而抑制神经炎症,改善肺癌诱导的骨癌痛[17]。CSP 属于一种复方草药,由制何首乌、守宫、生晒参、三七、梅花、没药组成,具有解毒散结、益肾填精等功效,可明显改善晚期恶性肿瘤患者血瘀症状[18]。徐国品等[19]研究证明CSP 可以减轻晚期非小细胞肺癌化疗患者的血液学毒性,提高免疫功能。但尚未有文献报道CSP 可以缓解肺癌诱导的骨癌痛。基于以上文献证明CSP 中梅花、没药能消肿止痛、活血通络;三七能化瘀止血;生晒参能健脾生津;制何首乌能补益经血;守宫能解毒散结、益肾填精。PWMT、PWTL 是生理性疼痛的重要指标。本研究发现肺癌诱导的骨癌痛大鼠PWMT、PWTL 明显降低,进一步表明模型制备成功,但经CSP 干预后,模型组大鼠PWMT、PWTL值明显升高,提示CSP 可以有效缓解肺癌诱导的骨癌痛大鼠疼痛,但由于该药物属于复合组分,目前猜测梅花、没药、三七起到主要作用,但具体成分在其中作用还在进一步核实中。

研究表明骨癌痛发生时,往往伴随炎症信号通路被激活,大量炎性介质被释放,如肿瘤细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6 等因子[15]。在乳腺癌诱导的骨癌大鼠研究中[20],TNF-α 可介导机械和热痛觉过敏,而IL-6 也可通过TNF-α 的升高引起机械性痛觉过敏,阻断上述信号有助于缓解骨癌疼痛。另外,何佩珊等[10]研究报道了肺癌骨转移癌痛小鼠血浆中炎性因子如TNF-α、IL-1β 水平明显升高,而香辛方通过下调炎性因子水平,进而缓解骨转移癌痛。本研究发现肺癌诱导的骨癌痛大鼠血清中IL-1β、IL-6 含量以及血清、组织中TNF-α 水平明显升高,提示骨癌痛发生可能与炎性信号通路激活有关。当CSP 干预后,上述指标发生逆转,提示CSP 可通过抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 表达,进而缓解骨癌痛大鼠疼痛。另外,研究发现在TNF-α诱导的炎性反应的形成中,MCP-1 表达可被上调[21]。本研究还发现MCP-1 在骨癌痛大鼠脊髓组织中表达水平显著升高,提示大鼠出现了痛觉中枢敏化,与以往研究结果相吻合[22-23]。但经CSP 治疗后,MCP-1 水平显著下降,表明CSP 可能通过抑制中枢敏化而起到止痛作用。

此外,在本研究中,高剂量CSP 对骨癌痛大鼠的改善作用与扶他林接近,但低、中剂量CSP的改善作用低于扶他林,推测其原因可能与CSP的剂量和扶他林的作用特点有关。扶他林为非甾体类抗炎药,主要具有镇痛、抗炎的作用,可抑制环氧合酶和体内前列腺素的生物合成,进而抑制炎性因子的释放,且扶他林外用能通过皮肤渗透到患处,缓解疼痛,具有起效快、安全性高等特点。CSP 对骨癌痛的改善作用是否与其给药途径有关,还有待深入分析。

综上所述,CSP 可能通过抑制TNF-α 炎性反应通路,抑制中枢敏化,进而缓解肺癌诱导的骨癌疼痛,但由于该疾病机制复杂,CSP 可能从多因素、多环节达到止痛目的,但是否有其他作用机制需进一步探索。