长链非编码RNA-ATB对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

高蜜阳，张荣明，熊亮，申锦帆，刘畅

（锦州医科大学附属第一医院 烧伤整形科，辽宁 锦州121000）

瘢痕疙瘩是由于伤口、创伤、烧伤、手术切口或疾病等导致瘢痕形成，主要与成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质的大量沉积有关[1]。瘢痕疙瘩的临床表现主要是高出皮肤的瘢痕组织生长，通常伴有瘙痒和疼痛。有研究显示瘢痕疙瘩的形成与基因调控、炎症因子、细胞因子和免疫因素等密切相关[2]。由于瘢痕疙瘩的发病机制和调控机制尚不清楚，瘢痕疙瘩的治疗仍未取得突破性进展。长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是非编码RNA的亚类，其长度超过200 nt，且具有比编码RNA 更强的组织和细胞特异性。lncRNA 在不同的细胞、组织及其不同的发育阶段中表达均不同，并参与各种疾病的发生、发展，同时在细胞分化、增殖、迁移、凋亡和代谢等过程中起着重要的调节作用[3]。有研究显示大量lncRNAs 在瘢痕疙瘩中存在异常表达，其中lncRNA AC073257.2 能够调控GLI2基因，参与成纤维细胞的生长、增殖；lncRNA HNF1A-AS1 能够调控HNF1A基因，参与瘢痕疙瘩的形成[4]。有研究显示被转化生长因子b 激活的长链非编码RNA（lncRNA-ATB）在肿瘤、外周血管疾病、动脉粥样硬化、骨关节炎、免疫性等疾病中发挥着重要作用[5-7]。然而ATB 在瘢痕疙瘩中的作用及机制尚未完全阐明。因此本研究采用RT-PCR 检测瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中ATB 的表达水平，并进一步深入探讨ATB 调控miR-200c/DNA 甲基转移酶DNMT3B 通路在瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡中的作用，证实ATB/miR-200c/DNMT3B 轴对瘢痕疙瘩形成的影响。

1 材料与方法

1.1 组织标本

选取2017年12月—2018年7月在锦州医科大学附属第一医院烧伤整形科接受瘢痕疙瘩治疗的30 例患者。其中，男性19 例，女性11 例；平均年龄（32.7±10.1）岁；在手术前均未接受药物治疗、放射治疗、化学治疗、激光治疗等。排除肿瘤、免疫性疾病及严重的肝肾功能不全患者。术中切除瘢痕疙瘩和少量周围正常皮肤组织，标本保存于液氮中用于进一步实验。同时分为瘢痕疙瘩组和正常皮肤组，以及瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞组与正常成纤维细胞组。患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

DMEM 细胞培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，CCK-8 试剂盒购自大连碧云天生物技术有限公司，磷酸盐缓冲液和胰蛋白酶购自上海思吉生物制品有限公司， RNA 逆转录试剂盒和Lipofectamine 2000 购自日本TaKaRa 公司，Trizol Reagent 和SYBR Green 购自美国Promega 公司，miRNeasy Mini Kit 购自德国Qiagen 公司，TaqMan MicroRNA Assay 试剂盒购自美国Applied Biosystems公司，兔抗人DNMT3B、周期素依赖性激酶6（CDK6）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和β-actin 抗体购自美国Abcam 公司，HRP 标记的羊抗兔IgG 购自美国CST 公司。sh-ATB、sh-DNMT3B、miR-NC、miR-200c mimics 和miR-200c inhibitors 由中国上海Genepharm 公司合成。通过PCR 扩增野生型（o/e-ATB） 或突变体（o/e-NC）ATB 片段，并亚克隆到pcDNA3.1 载体，pcDNA3.1载体购自美国Invitrogen 公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞购自中国科学院上海细胞库，采用含10%胎牛血清的DMEM 细胞培养基在37℃、5%二氧化碳平衡湿度培养箱中培养。取对数生长期细胞进行实验，采用Lipofectamine 2000 按试剂盒说明书转染sh-ATB、 o/e-ATB、 miR-200c mimics、 miR-200c inhibitors 和sh-DNMT3B，转染24 h 后用于进一步实验。同时根据不同转染方式分为：sh-NC 组、sh-ATB组、o/e-NC 组、o/e-ATB 组、miR-NC 组、miR-200c mimics 组、miR-200c inhibitors 组、共转染sh-ATB+miR-200c inhibitors 组、共转染o/e-ATB+miR-200c inhibitors 组、共转染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 组、共转染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 组。

1.3.2 qRT-PCR采用miRNeasy Mini Kit 提取miRNA，使用TaqMan MicroRNA Assay 试剂盒检测miR-200c 的相对表达量，并使用Applied Biosystem 7500 进行qRT-PCR，U6 作为内参。采用Trizol 提取组织和细胞中总RNA，使用NanoDrop 1000 分光光度计测定RNA 的浓度，使用PrimeScriptTMqRT-PCR试剂盒从总RNA 合成第一链互补DNA，并使用SYBR Green PCR Master Mix 进行qRT-PCR，以βactin 作为内参，按2-ΔΔCt法进行相对表达量分析。

1.3.3 细胞增殖转染后24 h 收集各组细胞，以2×104个密度接种到96 孔培养板中，各组细胞分别培养0 d、1 d、2 d 和3 d 后，加入10 μl 的CCK-8 溶液，在37℃下再孵育2 h，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度值。

1.3.4 细胞凋亡转染后24 h 收集各组细胞，以2×105个密度接种到6 孔培养板中，以2×104个密度接种到96 孔培养板中，加入10 μl Annexin VFITC 和5μl 碘化丙啶染色液（0.25 mg/ml），轻轻混匀，室温避光孵育20 min，用流式细胞仪进行检测。

1.3.5 双荧光素酶将野生型ATB（ATB-WT）、突变型ATB（ATB-MUT）、野生型DNMT3B（DNMT3B-WT）或突变型DNMT3B （DNMT3B-MUT）克隆到pmirGLO 质粒受体中，同时将miR-200c mimics 或miR-NC 导入293 细胞中，共培养48 h 后采用双荧光素酶受体分析系统测量双荧光素活性。

1.3.6 Western blotting转染后24 h 收集各组细胞，常规提取细胞总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，使用10% SDS-PAGE 凝胶分离等量（50 μg）蛋白质样品，110 V 电泳，250 mA 电转至PVDF 膜，5% 脱脂奶粉37℃封闭2 h。分别加入DNMT3B、CDK6、Caspase-3 和β-actin 一抗4℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，10 min/次，二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，30 min/次，ECL显影。并使用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin 作为内参，计算相对表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较用配对t检验、独立样本t检验或重复测量设计的方差分析，进一步的两两比较用Dunnett-t检验，相关性分析用Spearman 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATB 在瘢痕疙瘩组织和瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达

瘢痕疙瘩组与正常皮肤组ATB 相对表达量分别为（2.96±1.07）和（1.11±0.49），经t检验，差异有统计学意义（t=8.561，P=0.000），瘢痕疙瘩组较正常皮肤组高。瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞组与正常成纤维细胞组ATB 相对表达量分别为（2.37±0.26）和（1.07±0.12），经t检验，差异有统计学意义（t=7.814，P=0.001），瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞组较正常成纤维细胞组高。sh-NC 组与sh-ATB 组ATB 的相对表达量分别为（0.44±0.10）和（1.01±0.15），经t检验，差异有统计学意义（t=5.476，P=0.005），sh-ATB 组 较sh-NC 组 高。o/e-NC 组与o/e-ATB 组ATB 的相对表达量分别为（1.01±0.06）和（1.97±0.21），经t检验，差异有统计学意义（t=7.686，P=0.002），o/e-ATB 组较o/e-NC 组高。

2.2 低表达ATB对成纤维细胞细胞增殖和凋亡的影响

sh-ATB 组与sh-NC 组转染后不同时间点的成纤维细胞OD450 值比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点间的OD450 值比较有差异（F=180.102，P=0.000）；②sh-ATB 组与sh-NC 组的OD450 值比较有差异（F=61.130，P=0.000），sh-ATB 组较sh-NC组低；③sh-ATB组与sh-NC组的OD450 值变化趋势比较有差异（F=10.612，P=0.000）。同时sh-NC 组与sh-ATB 组CDK6 的相对表达量分别为（0.96±0.12）和（0.57±0.08），经t检验，差异有统计学意义（t=4.678，P=0.010），sh-ATB 组较sh-NC 组低（见图1）。进一步检测细胞凋亡情况，sh-NC 组与sh-ATB 组细胞的凋亡率分别为（6.97±1.43）%和（14.00±1.37）%，经t检验，差异有统计学意义（t=6.142，P=0.004），sh-ATB组较sh-NC 组高（见图2）。sh-NC 组与sh-ATB 组Caspase-3 的相对表达量分别为（0.99±0.12） 和（1.74±0.10），经t检验，差异有统计学意义（t=5.839，P=0.004），sh-ATB组较sh-NC组高（见图3）。见表1。

图1 sh-NC组与sh-ATB组CDK6相对表达量比较

图2 低表达ATB对成纤维细胞凋亡的影响

图3 低表达ATB对凋亡相关分子Caspase-3表达的影响

表1 sh-ATB组与sh-NC组转染后不同时间点的成纤维细胞OD450值比较 （x±s）

2.3 ATB靶向结合miR-200c

miR-NC 组ATB-WT 和ATB-MUT 双荧光素酶活性分别为（1.15±0.08） 和（1.07±0.09），miR-200c mimics 组分别为（0.47±0.04） 和（1.10±0.04）。两组ATB-WT 双荧光素酶活性比较，差异有统计学意义（t=13.083，P=0.000），两组ATB-MUT双荧光素酶活性比较，差异无统计学意义（t=0.469，P=0.664）。o/e-ATB 组miR-200c 相对表达量为（0.45±0.06），o/e-NC 组为（1.02±0.12），经t检验，差异有统计学意义（t=7.190，P=0.002），o/e-ATB 组低于o/e-NC 组。sh-NC 组与sh-ATB 组miR-200c 相对表达量分别为（0.97±0.12） 和（1.47±0.12），经t检验，差异有统计学意义（t=4.977，P=0.008），sh-ATB 组高于sh-NC 组。瘢痕疙瘩组与正常皮肤组miR-200c 相对表达量分别为（0.66±0.20）和（1.17±0.39），经t检验，差异有统计学意义（t=6.461，P=0.000），瘢痕疙瘩组低于正常皮肤组。经Spearman 相关分析，ATB 与miR-200c 在瘢痕疙瘩组织中的表达水平呈负相关（rs=-3.429，P=0.000）（见图4）。miR-NC 组miR-200c 相对表达量为（1.01±0.13），miR-200c mimics 组相对表达 量为（1.54±0.10）， miR-200c inhibitors 组为（0.45±0.08），经方差分析，差异有统计学意义（F=76.010，P=0.000），成纤维细胞细胞转染miR-200c mimics 后能够促进miR-200c 的表达，转染miR-200c inhibitors 后能够抑制miR-200c 的表达。

图4 ATB与miR-200c在瘢痕疙瘩组织中表达的相关性

2.4 过表达miR-200c 对成纤维细胞细胞增殖和凋亡的影响

miR-200c mimics 组和miR-NC 组转染后不同时间点的成纤维细胞OD450 值比较，经重复测量设计的方差分析显示：①不同时间点间的OD450 值比较有差异（F=331.764，P=0.000）；②两组的OD450值比较有差异（F=155.169，P=0.000），miR-200c mimics 组较miR-NC 组低；③两组的OD450 值变化趋势比较有差异（F=17.397，P=0.000）。miR-NC组与miR-200c mimics 组CDK6 的相对表达量分别为（1.00±0.16）和（0.45±0.07），经t检验，差异有统计学意义（t=5.529，P=0.005），miR-200c mimics组较miR-NC 组低（见图5）。miR-NC 组与miR-200c mimics 组细胞凋亡率分别为（7.40±0.28）%和（16.53±1.14）%，经t检验，差异有统计学意义（t=9.252，P=0.001）（见图6），miR-200c mimics 组较miR-NC 组高。miR-NC 组 与miR-200c mimics 组Caspase-3 的相对表达量分别为（1.02±0.22） 和（1.63±0.09），经t检验，差异有统计学意义（t=4.467，P=0.011）（见图7），miR-200c mimics 组较miR-NC 组高。见表2。

图5 过表达miR-200c对增殖相关分子CDK6表达的影响

图6 过表达miR-200c对成纤维细胞凋亡的影响

图7 过表达miR-200c对凋亡相关分子Caspase-3表达的影响

表2 miR-200c mimics组和miR-NC组转染后不同时间点的成纤维细胞OD450值比较 （±s）

表2 miR-200c mimics组和miR-NC组转染后不同时间点的成纤维细胞OD450值比较 （±s）

组别0 d 1 d 2 d 3 d miR-NC组miR-200c mimics组0.56±0.03 0.56±0.01 1.16±0.07 0.65±0.10 1.71±0.10 1.15±0.12 2.22±0.17 1.64±0.14

2.5 miR-200c能够靶向结合DNMT3B

miR-200c mimics 组DNMT3B-WT 和DNMT3BMUT 荧光素酶活性分别为（0.58±0.04） 和（0.97±0.08），miR-NC 组分别为（0.98±0.07） 和（1.04±0.07）。两组DNMT3B-WT 荧光素酶活性比较，差异有统计学意义（t=8.094，P=0.001），转染miR-200c mimics 后双荧光素活性下降。两组DNMT3B-MUT 荧光素酶活性比较，差异无统计学意义（t=1.090，P=0.337）。miR-NC 组与miR-200c mimics 组DNMT3B 蛋白相对表达量分别为（1.02±0.05）和（0.51±0.04），经t检验，差异有统计学意义（t=13.796，P=0.000），miR-200c mimics 组较miR-NC 组低（见图8）。miR-NC 组 与miR-200c inhibitors 组DNMT3B 蛋白相对表达量分别为（1.04±0.07）和（1.47±0.11），经t检验，差异有统计学意义（t=5.712，P=0.005），miR-200c inhibitors 组 较miRNC 组高。瘢痕疙瘩组与正常皮肤组DNMT3B 相对表达量分别为（2.28±0.70）和（1.03±0.30），经t检验，差异有统计学意义（t=9.025，P=0.000），瘢痕疙瘩组较正常皮肤组高。经Spearman 分析，miR-200c与DNMT3B 在瘢痕疙瘩组织中的表达水平呈负相关（rs=-2.011，P=0.001）（见图9），ATB 与DNMT3B 在瘢痕疙瘩组织中的表达水平呈正相关（rs=0.829，P=0.002）（见图10）。

图8 瘢痕疙瘩成纤维细胞转染染miR-NC、miR-200c mimics和miR-200c inhibitors后DNMT3B的表达水平

图9 miR-200c与DNMT3B在瘢痕疙瘩组织中表达的相关性

图10 ATB与DNMT3B在瘢痕疙瘩组织中表达的相关性

2.6 ATB 调控miR-200c/DNMT3B 通路参与成纤维细胞细胞的增殖和凋亡

共转染sh-ATB+miR-200c inhibitors 组与sh-NC组转染后不同时间点的成纤维细胞OD450 值比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点间的OD450 值比较有差异（F=192.560，P=0.000）；②两组OD450 值比较无差异（F=4.339，P=0.054）；③两组OD450 值变化趋势比较无差异（F=1.024，P=0.409）。共转染sh-ATB+miR-200c inhibitors 组与sh-ATB 组成纤维细胞OD450 值比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点间的OD450 值比较有差异（F=138.352，P=0.000）；②两组OD450值比较有差异（F=27.567，P=0.000）；③两组OD450 值变化趋势比较有差异（F=4.235，P=0.022）。sh-NC 组与共转染sh-ATB+miR-200c inhibitors 组细胞凋亡率分别为（6.97±1.43）%和（7.60±1.35）%，经t检验，差异无统计学意义（t=0.559，P=0.606）。见表3。

共转染o/e-ATB+miR-200c inhibitors 组与o/e-ATB 组转染后不同时间点的成纤维细胞OD450 值比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点间的OD450 值比较有差异（F=271.965，P=0.000）；②两组OD450 值比较有差异（F=42.868，P=0.000）；③两组OD450 值变化趋势比较有差异（F=7.459，P=0.002）。共转染o/e-ATB 和miR-200c inhibitors 组和o/e-ATB 组细胞凋亡率分别为（2.37±0.85）%和（4.35±0.60）%，经t检验，差异有统计学意义（t=3.302，P=0.030），o/e-ATB 组较共转染o/e-ATB+miR-200c inhibitors组高。见表4。

共转染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 组与miR-NC 组转染后不同时间点的成纤维细胞OD450值比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点间的OD450 值比较有差异（F=177.080，P=0.000）；②两组OD450 值比较无差异（F=0.002，P=0.964）；③两组OD450 值变化趋势比较无差异（F=2.661，P=0.083）。共转染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 组与miR-200c inhibitors 组成纤维细胞OD450 值比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点间的OD450 值比较有差异（F=171.475，P=0.000）；②两组OD450 值比较有差异（F=45.448，P=0.000）；③两组OD450 值变化趋势比较有差异（F=6.883，P=0.003）。miR-NC 组与共转染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 组细胞凋亡率分别为（7.40±1.28）%和（6.63±0.91）%，经t检验，差异无统计学意义（t=0.848，P=0.444）。见表5。

共转染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 组与miR-200c mimics 组转染后不同时间点的成纤维细胞OD450 值比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点间的OD450 值比较有差异（F=83.287，P=0.000）；②两组OD450 值比较有差异（F=14.702，P=0.002）；③两组OD450 值变化趋势比较有差异（F=5.401，P=0.009）。共转染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 组 与miR-200c mimics 组 细胞 凋 亡 率分别为（21.17±1.41）% 和（16.53±1.14）%，经t检验，差异有统计学意义（t=4.440，P=0.011），共转染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 组较miR-200c mimics 组高。这提示ATB 能够通过调控miR-200c/DNMT3B 通路参与成纤维细胞的增殖和凋亡。见表6。

表3 共转染sh-ATB和miR-200c inhibitors对成纤维细胞细胞增殖的影响 （±s）

表3 共转染sh-ATB和miR-200c inhibitors对成纤维细胞细胞增殖的影响 （±s）

组别0 d 1 d 2 d 3 d sh-NC组sh-ATB组共转染sh-ATB+miR-200c inhibitors组0.57±0.05 0.57±0.02 0.59±0.03 0.93±0.15 0.73±0.13 0.88±0.06 1.63±0.13 1.15±0.15 1.45±0.13 2.06±0.17 1.48±0.13 1.90±0.09

表4 共转染o/e-ATB和miR-200c inhibitors对成纤维细胞细胞增殖的影响 （±s）

表4 共转染o/e-ATB和miR-200c inhibitors对成纤维细胞细胞增殖的影响 （±s）

组别0 d 1 d 2 d 3 d o/e-NC组o/e-ATB组共转染o/e-ATB+miR-200c inhibitors组0.58±0.04 0.56±0.03 0.57±0.03 0.98±0.18 1.29±0.19 1.65±0.16 1.58±0.10 2.06±0.17 2.45±0.16 1.97±0.10 2.44±0.17 3.25±0.16

表5 共转染miR-200c inhibitors和sh-DNMT3B对成纤维细胞细胞增殖的影响 （±s）

表5 共转染miR-200c inhibitors和sh-DNMT3B对成纤维细胞细胞增殖的影响 （±s）

组别0 d 1 d 2 d 3 d miR-NC组miR-200c inhibitors组共转染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B组0.56±0.03 0.58±0.01 0.57±0.02 1.11±0.14 1.62±0.14 1.20±0.14 1.71±0.10 2.31±0.17 1.46±0.13 2.22±0.17 2.87±0.27 2.38±0.22

表6 共转染miR-200c mimics和sh-DNMT3B对成纤维细胞细胞增殖的影响 （±s）

表6 共转染miR-200c mimics和sh-DNMT3B对成纤维细胞细胞增殖的影响 （±s）

组别0 d 1 d 2 d 3 d miR-NC组miR-200c mimics组共转染miR-200c mimics+sh-DNMT3B组0.57±0.03 0.56±0.01 0.57±0.02 1.16±0.07 0.65±0.10 0.64±0.13 1.71±0.10 1.15±0.13 0.89±0.09 2.22±0.17 1.64±0.14 1.23±0.14

3 讨论

在瘢痕疙瘩的研究中，越来越多的研究开始转向LncRNAs 和miRNAs 对瘢痕疙瘩的调控作用[8]。目前采用基因芯片证实在瘢痕疙瘩存在大量异常表达的LncRNAs 和miRNAs，其中有研究显示在瘢痕疙瘩中有1 731 种lncRNAs 表达上调，782 种lncRNAs 表达下调[9]。LncRNAs 能够通过多种途径参与疾病的调控，其中最常见的是ceRNA 机制，即LncRNAs 靶向结合miRNAs，进而调控下游分子的表达。miRNAs 是一类非编码的小RNA，长度只有20～24 nt，在生物体基因组中普遍存在。目前研究证实miRNAs 只占所有RNA 的1.0%左右，但能够调控机体30%～50%基因表达[10]。miRNAs 通过靶向调控靶mRNA，参与细胞增殖、分化、侵袭、迁移和凋亡等多种细胞生物学行为。随着对miRNAs 研究的深入，越来越多的证据表明miRNAs参与瘢痕疙瘩的形成[11]。然而关于LncRNAs 调控miRNAs 在瘢痕疙瘩中的研究尚少。

在本研究中采用qRT-PCR 检测瘢痕疙瘩组织和瘢痕疙瘩成纤维细胞中ATB 相对表达量，结果显示ATB 在瘢痕疙瘩组织中的表达水平明显高于正常皮肤，同时在瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞中ATB的表达水平明显高于正常成纤维细胞。这提示ATB在瘢痕疙瘩中存在明显异常表达。在进一步的研究中采用shRNA 干扰技术在成纤维细胞中低表达ATB，结果显示低表达ATB 能够明显抑制细胞增殖，并促进细胞凋亡，同时下调增殖相关分子CDK6，上调凋亡相关分子Caspase-3 的表达水平。这提示ATB 参与瘢痕疙瘩的形成。然而其作用机制有待进一步探讨。

有研究显示miR-152-3p、miR-21、miR-200c和miR-203 在瘢痕疙瘩中均存在异常表达，并参与瘢痕疙瘩的形成[12-14]。同时研究显示LncRNA HOXA11-AS 能够靶向结合miR-124-3p 而抑制Smad5 的表达，参与瘢痕疙瘩细胞外基质的形成[15]。最近有研究显示，ATB 能够通过调控miR-200c 参与结直肠癌的发生发展[16]。在本研究中，双荧光素酶结果显示ATB 能够靶向结合miR-200c，同时在成纤维细胞细胞中转染o/e-ATB 后能够明显抑制miR-200c 的表达水平，在转染sh-ATB 后能够明显促进miR-200c 的表达水平，这说明在成纤维细胞中ATB 能够靶向抑制miR-200c。在进一步的人体瘢痕疙瘩组织中也正证实ATB 与miR-200c 的表达水平呈负相关。

为证实miR-200c 在成纤维细胞中发挥的作用，采用miR-200c mimics 过表达miR-200c 后能够明显抑制细胞增殖，并促进细胞凋亡，同时下调增殖相关分子CDK6 和上调凋亡相关分子Caspase-3 的表达水平。这一结果与低表达ATB 对成纤维细胞的作用相似，更进一步提示ATB 能够靶向结合miR-200c 而抑制miR-200c 的表达水平。

DNA 甲基化是表观遗传学中一种重要的修饰方式，主要是通过DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferase, DNMT）来催化和维持起作用[17]。DNMT家族成员在生命的各种活动中均发挥重要作用，包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A 和DNMT3B，后两者主要在哺乳动物中发挥作用[18]。DNMT3B 是从头DNA 甲基化转移酶，可以不需要甲基化的DNA 作模板，即可完成非甲基化的DNA 的甲基化修饰，研究显示DNMT3B 参与了肿瘤、血管性疾病和免疫性疾病等[19]。同时也有研究显示DNMT3B 在瘢痕组织中的表达水平明显升高[20]。在本研究中双荧光素酶结果显示miR-200c 能够靶向结合DNMT3B，同时在成纤维细胞细胞中转染miR-200c mimics 后能够明显抑制DNMT3B 蛋白的表达水平，在转染miR-200c inhibitors 后能够明显促进DNMT3B 蛋白的表达。 这进一步提示miR-200c 能够靶向结合DNMT3B，进而抑制DNMT3B 的表达。同时miR-200c 与DNMT3B 在瘢痕疙瘩组织中的表达水平呈负相关，ATB 与DNMT3B 在瘢痕疙瘩组织中的表达水平呈正相关，这提示ATB 可能通过靶向抑制miR-200c，进而促进DNMT3B 的表达，最后参与成纤维细胞细胞增殖和凋亡。

在进一步的回复验证试验中，已证实lncRNAATB/miR-200c/DNMT3B 轴在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的作用。结果显示在瘢痕疙瘩成纤维细胞中共转染sh-ATB 和miR-200c inhibitors 能够逆转单独转染sh-ATB 对细胞增殖和凋亡的影响，共转染o/e-ATB和miR-200c inhibitors 能够进一步加强单独转染o/e-ATB 对细胞增殖和凋亡的影响；瘢痕疙瘩成纤维细胞中共转染miR-200c inhibitors 和sh-DNMT3B 能够逆转单独转染miR-200c inhibitors 对细胞增殖和凋亡的影响，共转染miR-200c mimics 和sh-DNMT3B能够进一步加强单独转染miR-200c mimics 对细胞增殖和凋亡的影响。这进一步证实ATB 能够通过调控miR-200c/ DNMT3B 通路参与成纤维细胞增殖和凋亡。

综上所述，ATB 在瘢痕疙瘩组织中高表达，低表达ATB 能够通过调控miR-200c/DNMT3B 通路，抑制成纤维细胞增殖，并促进细胞凋亡。lncRNAATB/miR-200c/DNMT3B 轴在瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和凋亡中发挥着重要作用。ATB 可能成为瘢痕疙瘩治疗的新靶点。