丙泊酚对脂多糖诱导的BV2 细胞中炎性因子表达的影响

徐雅洁,刘争杰,董诺亚

河北港口集团有限公司港口医院麻醉科 河北省秦皇岛市,066002

小胶质细胞(microglia) 是中枢神经系统中重要的免疫细胞[1]。当神经中枢受到伤害,感染或有炎症刺激时,小胶质细胞向M1 和M2 型活化[2-3]。M1 型活化中,小胶质细胞汇集在受损神经细胞周围形成脑内的巨噬细胞,产生大量促炎细胞因子和氧化代谢产物,例如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)、NO 和活性氧(reactive oxygen species,ROS) 等炎性因子[4]。败血症等全身炎症状态下,小胶质细胞吞噬星形胶质细胞的末端,损害了血脑屏障功能[5],进而可能损害认知功能、增加脑部疾病风险[6]。

丙泊酚(propofol) 又称异丙酚,是一种常用麻醉静脉注射制剂,适用于包括老人和小儿的多种术前麻醉,具有血流动力学稳定、术后恢复时间短、安全等特点[7-8]。之前的研究证实丙泊酚在不同细胞和疾病模型中具有抗氧化[9]和抗炎作用[10]。当前有广泛的研究表明,除了作为麻醉剂,丙泊酚对多种因素诱导的炎性脑病具有良好的抑制作用[11-12]。如减轻脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的认知损害、神经炎症和氧化应激[13]。然而,如果丙泊酚仅仅作为一种麻醉剂减轻大脑活动从而减轻神经损害,则其广泛的副作用可能会导致其在神经中枢的保护作用失去开发价值。因此,本研究旨在探讨丙泊酚通过调控相关核转录因子-κB (nuclear transcription factor-κB,NF-κB) 通路对活化的小胶质细胞炎性因子的影响。

1 材料和方法

1 材料

细胞: 小鼠小胶质细胞BV2 细胞购于上海钰博生物科技有限公司。

主要试剂和仪器: 丙泊酚购自江苏恩华药业股份有限公司 (国药准字H20123138,产品批号BB211010);ROS 检测试剂盒 (S0033M,含DCFH-DA 和活性氧标准对照品) 和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS) 检测试剂盒[S0025,含NOS 检测缓冲液(2 ×)、精氨酸溶液、NADPH和5 mmol/L DAF-FMDA] 购自上海碧云天生物技术公司;LPS (L8880)、CCK-8 试剂盒(CA1210,含CCK-8 工作液)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)(SEKM-0034)、IL-1β (SEKM-0002) 和 IL-6(SEKM-0007) 酶联免疫吸附实验(ELISA) 试剂盒、羊抗兔IgG-HRP (SE134)、ECL 化学发光检测试剂盒(PE0010,含溶液A 和B)、高效RIPA(radio immunoprecipitation assay) 裂解液(R0010)和BCA (bicinchoninic acid) 蛋白浓度测定试剂盒(PC0020) 购自北京索莱宝科技有限公司;兔抗NLRP3 单克隆抗体(1∶1 000,#13158)、兔抗含半胱氨酸-天冬氨酸酶募集结构域的凋亡相关斑点状蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC) 单克隆抗体(1∶1 000,#13833)、兔抗Caspase-1 单克隆抗体(1∶1 000,#3866)、兔抗GAPDH 单克隆抗体(1∶3 000,#2118)、兔抗IκB 单克隆抗体(1 ∶1 000,#9244)、兔抗P65 单克隆抗体(#8242)、兔抗p-P65 单克隆抗体(#3033) 和兔抗Lamin 单克隆抗体(1∶1 000,#12255) 等均购自美国CST公司;免疫荧光实验用的Alexa Fluor®488 荧光素偶联的山羊抗兔IgG (1∶200,ab150077),普通山羊抗兔 IgG H&L (HRP) 二抗 (1 ∶4 000,ab205718) 和细胞核染料DAPI (ab104139) 购自英国Abcam 公司。SuPerMax 3100 型多功能酶标仪购于上海闪谱生物科技有限公司。SH-Focus 523 超灵敏化学发光成像仪购自杭州申花科技。Ixplore 荧光倒置显微镜购自奥林巴斯。

1.2 BV2 细胞培养

将BV2 细胞接种到含有10 %胎牛血清、100 U/mL 青霉素和链霉素的DMEM 培养液中,48 h 换1 次液,2～3 d 传1 次代,传代2 次后用于后续实验[14]。

1.3 细胞分组

将BV2 细胞分为5 组: 对照组 (Control)、LPS 模型组(加入100 ng/mL LPS)、丙泊酚低剂量组(prof-L,加入100 ng/mL LPS 与20 μmol/L丙泊酚)、丙泊酚中剂量组(prof-M,加入100 ng/mL LPS 与50 μmol/L 丙泊酚) 和丙泊酚高剂量组(prof-H,加入100 ng/mL LPS 与100 μmol/L 丙泊酚),用于实验研究。

1.4 CCK-8 检测

使用CCK-8 试剂盒,按照操作说明,检测丙泊酚和LPS 处理的BV2 细胞活力。将细胞接种至两块24 孔板,每孔1 ×104个细胞,用20、50 和100 μmol/L 的丙泊酚分别处理上述其中1 个24 孔板的细胞,另1 个24 孔板中加入上述丙泊酚后每孔再加100 ng/mL LPS,在37 ℃5 % CO2条件下培养24 h。将10 μL CCK-8 溶液添加至上述孔中,再培养2 h。用多功能酶标仪检测每个孔在450 nm 处的吸光度[15]。CCK-8 实验重复3 次。

1.5 检测ROS 水平

根据ROS 检测试剂盒厂商使用说明进行操作。按照1∶1 000 用无血清培养液稀释荧光探针DCFHDA,使终浓度为10 μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA 中,细胞浓度为(1～2) ×107个/mL,37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3～5 min 颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3 次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用酶标仪在525 nm 处测定光吸收值,计算BV2 细胞的ROS 水平[16]。

1.6 NOS 活性检测

按照NOS 检测试剂盒厂商使用说明操作。把待检测的细胞或组织培养到96 孔板内,培养16～24 h 后细胞为80 %～90 %为宜。留一个孔作为没有细胞的空白对照。使用酶标仪在515 nm 处测定光吸收值,计算BV2 细胞的NOS 活性[17]。

1.7 ELISA 检测TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量

根据TNF-α、IL-1β 和IL-6 ELISA 检测试剂盒厂商使用说明进行操作,使用酶标仪在450 nm 处测定光吸收值,计算BV2 细胞的TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量[18]。

1.8 免疫荧光检测

细胞接种在盖玻片上,加药处理后,用4 %多聚甲醛固定15 min,0.5 % Triton X-100 透化20 min。然后,用正常山羊血清封闭细胞30 min,用P65 抗体(1∶1 600) 4 ℃孵育过夜。随后,用PBS洗涤细胞,与Alexa Fluor®488 偶联的羊抗兔IgG 孵育,并用DAPI 重新染色。在显微视镜下观察斑点。显微图像处理如前所述[19]。所有实验重复3 次。

1.9 Western 印迹检测

收集各组细胞,加入RIPA 裂解液(50 mmol/L Tris pH 7.4,150 mmol/L NaCl,1 % NP-40,0.5 %脱氧胆酸钠,0.1 % SDS) 裂解细胞,离心后取上清,用BCA 法检测蛋白浓度,在上清中加入凝胶上样缓冲液。用SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白,并转移到PVDF 膜上。用5 %脱脂牛奶封闭2 h,加入兔抗NLRP3、ASC、Caspase-1、GAPDH、IκB、P65、p-P65 和Lamin 单克隆抗体 (各1 ∶1 000),4 ℃下孵育过夜。PBS 洗涤3 次,每次5 min,HRP 标记的羊抗兔IgG (1∶10 000) 二抗孵育1 h。PBS 洗涤3 次,每次15 min。用ECL 化学发光检测试剂盒在凝胶成像仪观察这些条带[19]。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 丙泊酚对LPS 诱导的BV2 细胞活力无影响

本研究用100 ng/mL LPS 活化BV2 细胞后,再用prof-L (20 μmol/L)、prof-M (50 μmol/L) 和prof-H (100 μmol/L) 剂量丙泊酚处理细胞,LPS组和3 个丙泊酚组的BV2 细胞活性与对照组比较,均无细胞活力的显著影响(P＞0.05)。由此表明,LPS 和3 种浓度丙泊酚对BV2 细胞无毒性(图1)。

图1 丙泊酚对LPS 激活的BV2 细胞活力影响

2.2 丙泊酚缓解了LPS 诱导的BV2 细胞炎性样形态

显微观察发现,与对照组比较,LPS 组的BV2小胶质细胞胞体变圆且膨胀,突起变粗,趋向抱团聚集,表明成功建立神经系统炎症模型;prof-H 处理后,对BV2 细胞的形态表现介于对照组与LPS组之间(图2)。由此表明,丙泊酚缓解了LPS 活化的BV2 细胞炎性样形态。

图2 丙泊酚对BV2 细胞炎性样形态的影响(×200)

2.3 丙泊酚降低LPS 诱导的BV2 细胞炎性因子分泌

对培养基和细胞匀浆的ELISA 检测中,LPS 活化的BV2 细胞与对照组比较IL-6、IL-1β、TNF-α、ROS 和NOS 的含量显著增加(P＜0.01);经过丙泊酚处理后,IL-6、IL-1β、TNF-α、ROS 和NOS的含量与LPS 组比较,具有剂量依赖性下调,LPS +prof-M 组下调明显(P＜0.05),LPS +prof-H 组下调最显著(P＜0.01) (图3)。由此表明,丙泊酚降低了LPS 活化的BV2 细胞的炎性因子的表达水平。

完全租赁模式下，投资主体拥有养老项目的特许经营权，在经营期内将项目进行出租，由承租的运营主体进行经营，运营主体不持有股权。投资主体的收入主要来自约定的租赁费用，不承担其他风险，运营主体自负盈亏。

图3 丙泊酚对BV2 细胞炎症的影响

2.4 丙泊酚抑制LPS 诱导的NLRP3 炎性小体活化

Western 印迹检测中,与对照组比较,LPS 组细胞的NLP3、ASC 和Caspase-1 的蛋白表达显著上调(P＜0.01);丙泊酚处理后,BV2 细胞的NLP3、ASC 和Caspase-1 的蛋白表达与LPS 组比较,呈剂量依赖性下调,LPS +prof-M 组下调显著(P＜0.05),LPS+prof-H 组下调最明显 (P＜0.01) (图4)。由此得出,丙泊酚阻碍了LPS 诱导的BV2 细胞的炎性小体的活化。

图4 丙泊酚对NLRP3 炎性小体活化的影响

2.5 丙泊酚在BV2 细胞中抑制LPS 诱导的NF-κB

Western 印迹结果表明,与对照组比较,LPS组的IκB 蛋白表达显著下降(P＜0.01),而p-P65/P65 的表达比例显著升高(P＜0.01);经过丙泊酚处理后,与LPS 组比较,BV2 细胞的IκB 的蛋白表达呈剂量依赖性升高,LPS +prof-M 组显著升高(P＜0.05),LPS+prof-H 组升高最为明显(P＜0.01),而p-P65/P65 的表达比例呈剂量依赖性下降,LPS+prof-M 组显著下降(P＜0.05),LPS+prof-H 组下降最为明显(P＜0.01) (图5A)。

图5 丙泊酚对NF-κB 信号通路的影响

免疫荧光检测的结果表明,相较于对照组,LPS 组每个BV2 细胞中的核定位P65 蛋白显著性增多(P＜0.01);经过丙泊酚处理之后,与LPS组比较,每个BV2 细胞的核定位P65 蛋白呈剂量依赖性减少,LPS+prof-M 组显著减少 (P＜0.05),LPS+prof-H 组减少最为明显(P＜0.01)(图5B)。

上述结果表明,丙泊酚抑制了LPS 诱导的BV2细胞的NF-κB 通路的活化。

2.6 丙泊酚通过抑制NF-κB 减少BV2 细胞的炎性因子分泌

Western 印迹表明,LPS 组的IκB 表达与对照组比较,显著降低(P＜0.01);与LPS 组比较,LPS+prof-H 组的IκB 表达显著升高(P＜0.05),加入NF-κB 通路抑制剂SC75741 的LPS +SC75741组的IκB 表达也显著升高(P＜0.05);与LPS +SC75741 组比较,LPS +prof-H +SC75741 组的IκB表达显著升高(P＜0.05)。p-P65/P65 表达趋势与IκB 的表达呈现相反结果(图6A)。在此基础上,测定炎性因子IL-6 和IL-1β 的含量。结果显示,与对照组比较,LPS 组的IL-6 和IL-1β 的含量显著增多(P＜0.01);与LPS 组比较,LPS +prof-H 组的IL-6 和IL-1β 的含量显著降低(P＜0.01),LPS +SC75741 组的IL-6 和IL-1β 的含量也显著降低;与LPS+SC75741 组比较,LPS +prof-H +SC75741 组的IL-6 和IL-1β 的含量显著降低(P＜0.05) (图6B、C)。上述结果进一步证实了丙泊酚通过抑制NF-κB 信号通路减弱活化的小胶质细胞的促炎性因子水平。

图6 丙泊酚通过NF-κB 信号通路减少BV2 细胞炎症

3 讨论

研究表明,激活的NF-κB 增强NLRP3 的表达并增强NLRP3-炎性小体的活性,从而触发促炎因子的成熟和分泌[23]。在D-半乳糖胺/脂多糖诱导的急性肝损伤小鼠模型中,丙泊酚显著抑制NF-κB和NLRP3 炎性小体蛋白,从而抑制炎症、氧化应激和凋亡,并明显减轻肝损伤[24]。类似的效果也见于LPS 诱导的急性肺损伤大鼠模型中[25]。而在缺血再灌注损伤的大脑中动脉闭塞小鼠模型中,丙泊酚阻断NLRP1-caspase-1-caspase-6 回路,抑制NLRP3 激活和相关炎性因子释放,减轻再灌注损伤[26]。我们的研究进一步说明,对于LPS 诱导的小胶质细胞炎症,丙泊酚具有良好的控制效果。而且,我们证明了丙泊酚对小胶质细胞炎症的抑制,是通过抑制NF-κB 调控的NLRP3 炎性体活化实现的。

另一方面,丙泊酚本身也可能诱导神经炎症。在50 mg/kg 剂量下,丙泊酚显著诱导的脑组织炎症,其表现就包括NF-κB 激活,IL-1β,IL-6 等的分泌[27],该过程可能受某些调控RNA 和促红细胞生成素等的影响[28]。总体而言丙泊酚在人体内具有诱导和拮抗炎症的双重作用[29],其作用效果或许取决于病理状态以及药物剂量[30]。而丙泊酚在联合其他药物时,能表现出更显著的抗炎效果,如与七氟醚联用时更有效减轻LPS 诱导的肺损伤[31]。另外,作为一种麻醉剂,如果用以减轻神经炎症,其麻醉效应及原有的呼吸循环抑制、惊厥等副作用可能会比较多,难于直接用于临床。我们的研究发现,丙泊酚对小胶质细胞的炎症具有良好的抑制作用,而小胶质细胞作为中枢巨噬细胞,对脑内炎症的激发和持续都有重要的意义[5]。这些提示了丙泊酚的抗炎作用并不依赖其麻醉效应,具有潜在的临床价值,其具体机制的进一步阐明,可推动基于丙泊酚的抗败血症相关的炎性脑病的药物开发。

综上所述,LPS 上调小胶质BV2 细胞中的ROS 水平,然后刺激NF-κB P65 进入细胞核,激活NF-κB 信号通路并激活NLRP3 炎性小体表达,最终导致各种促炎因子的表达增加。而丙泊酚逆转了NF-κB 信号通路和NLRP3 炎性小体的激活,抑制了LPS 诱导的BV2 细胞促炎性因子水平。