LncRNA HOTAIR 通过miR-130a-3p/ABCC5 调控乳腺癌细胞紫杉醇耐药的分子机制研究

何宇,袁志鹏,卢志斌,廖景升,贾筠

东莞市人民医院肿瘤内科 广东省东莞市,523000

乳腺癌(breast cancer,BC) 是全世界女性最常见的恶性肿瘤之一,每年约有25 %的女性恶性肿瘤患者或150 万女性被诊断出患有乳腺癌[1]。当前针对BC 患者的临床治疗方法包括手术治疗和术后化疗、靶向治疗或放射治疗[2]。化学疗法以不同的分子机制起作用,在初始治疗阶段协同作用可以消除大多数肿瘤细胞[3]。紫杉醇 (paclitaxel,Taxol) 是一类紫杉烷类药物,是许多癌症中广泛使用的化学治疗剂,用于治疗包括BC 在内的各种类型的恶性肿瘤[4]。然而,耐药性的频繁发展(主要是紫杉醇耐药) 仍然是BC 患者治疗的主要障碍,通常会导致患者肿瘤复发甚至死亡。因此,迫切需要阐明BC 发展和化学疗法耐药性的分子机制,对寻找乳腺癌中新的生物标志物和开发新的治疗方法具有十分重要的意义。长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA) 可用作监测乳腺癌患者的新的诊断和治疗生物标志物[5]。LncRNA是一类长度超过200 个核苷酸的非编码RNA,在调节基因表达和细胞稳态方面具有重要作用[6]。已发现非编码RNA HOX 反义基因间RNA (HOX antisense intergenic RNA,HOTAIR) 与多种癌症的细胞转移密切相关,包括乳腺癌[7]。值得注意的是,HOTAIR 在乳腺癌中的表达增加,这为肿瘤转移和患者死亡提供了强有力的生物标志物[8]。然而,HOTAIR 在BC 中是否参与紫杉醇耐药仍然未知。MCF-7 是一种常用的乳腺癌细胞系,已被多个研究小组推广了40 多年,具有非常好的研究背景,包括分子谱、增殖、迁移、侵袭、球状体形成、其参与血管生成和淋巴管生成及其与间充质干细胞的相互作用[9]。基于此,本研究旨在探讨LncRNA HOTAIR 调控乳腺癌细胞紫杉醇耐药的潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

对照RNA、miRNA、ATP 结合盒亚家族C 成员5 (ATP binding cassette subfamily C member 5,ABCC5) 的小干扰RNA、HOTAIR 以及过表达质粒均由北京擎科设计合成。乳腺癌细胞系MCF7购自北京赛博润特科技发展中心 (货号:636315)。DMEM 培养基购自昆明皇宝商贸有限公司 (货 号: D917523-500 mL)。Lipofectamine 3000 试剂转染购自北京绿源大德生物科技有限公司(货号: L3000015)。紫杉醇购自北京百灵威科技有限公司(货号: 985203)。MTT 细胞活力测定试剂盒购自上海邦景实业有限公司(货号:BJ-01 X6322)。细胞凋亡检测试剂盒购自北京金优科技有限公司(货号: MF123-02)。细胞周期分析试剂盒购自上海朝瑞生物科技有限公司(货号: GMS10137.2)。RNasin 购自广州市左克生物科技发展有限公司(货号: R2011)。TRIzol 试剂购自广州翔博生物科技有限公司 (货号: XBRN01)。ReverTra Ace qPCR RT Kit 购自北京沃格东方科技有限公司(货号: FSQ-101 C)。THUNDERBIRD SYBR®qPCR Mix 购自北京百灵克生物科技有限责任公司 (货号: QPS-201)。ABCC5抗体购自广州伟然生物科技有限公司 (货号:DF7149-50)。3-磷酸甘油酯脱氢酶 (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH) 抗体购自索森 (广州) 生物科技有限公司 (货号:S109002)。双荧光素酶检测试剂盒购自广州翔博生物科技有限公司(货号: E1910)。

1.2 细胞培养

乳腺癌细胞系MCF7 在添加了10 % FBS 和100 U/mL 青霉素/链霉素的DMEM 培养基中,并在5 % CO2培养箱中培养。在90 %的汇合处收集细胞,48～72 h 更换一次培养基。转染前,将1 ×106个乳腺癌细胞在6 孔板中用2 mL 完全培养基培养24 h,直到它们达到90 %融合。将对照RNA、miRNA、siABCC5、HOTAIR 用Lipofectamine 3000试剂转染到MCF7 细胞系中,并按照说明在Opti-MEM 无血清培养基中培养。根据Yang 等[10]的方法构建紫杉醇耐药乳腺癌细胞,MCF7 细胞随着连续传代以逐渐增加紫杉醇的浓度,最终处理25 代。得到的具有紫杉醇抗性的MCF7 细胞系,称为MCF7/TR。本研究所有实验处理乳腺癌的紫杉醇浓度为20 μmol/L。

1.3 细胞增殖水平的测定

使用MTT 细胞活力测定试剂盒检测细胞增殖水平。将转染的细胞接种在96 孔板中(200 μL,3 ×103个细胞/孔)。每孔加入10 μL MTT (5 mg/mL) 并继续孵育4 h,然后将沉淀溶解在二甲基亚砜中。在微孔板分光光度计下在490 nm 处测量吸光度。

1.4 细胞凋亡水平的测定

采用流式细胞仪检测Annexin V 和碘化丙啶的细胞凋亡。将细胞接种到组织培养瓶中以达到大约50 %的融合,使其附着12 h,然后用不同浓度的紫杉醇处理48 h。用紫杉醇(20 nmol/L) 处理细胞48 h。按照制造商的方案的指示,使用膜联蛋白V-FITC 缀合的细胞凋亡检测试剂盒和碘化丙啶。胰蛋白酶消化后收获细胞。流式细胞仪分析并评估每个样品。

1.5 细胞周期的测定

细胞周期分析试剂盒用于检测细胞周期进程。不同处理后,通过离心收集的细胞在预冷的PBS中洗涤。每个样品重复3 次。通过流式细胞仪获取数据,并通过FlowJo-V10 软件进行分析。

1.6 细胞内紫杉醇浓度的测定

使用靶向代谢质谱检测细胞内紫杉醇浓度。用紫杉醇处理乳腺癌细胞2 h 后,收获细胞培养基以测试细胞外药物浓度。彻底洗涤后通过超声匀浆制备细胞,500 μL 上清液与甲醇混合。样品在真空干燥器中干燥并重新溶解在200 μL HPLC 级甲醇中。使用与线性阱四极杆-Orbitrap Velos Pro 质谱仪在线耦合的UltiMate 3000 UPLC 系统,通过液相色谱(LC)/电喷雾电离(ESI) -串联MS 测量药物。

1.7 转录组测序

将以下4 组MCF/TR 细胞进行转录组测序:①敲低对照组;②敲低HOTAIR 组;③转染纯化对照组;④转染Bio-HOTAIR 后纯化HOTAIR 相互作用RNA 组。每组设3 个重复,提取总RNA,送上海迈博生物医药科技有限公司使用Illumina HiSeqTM2500 测序仪进行转录组测序。数据通过Majorbio Cloud Platform 的免费在线平台进行分析。

1.8 纯化HOTAIR 相互作用RNA

将pcDNA3-strep-MS2 和pcDNA3-strep-HOTAIR共转染到MCF-TR 细胞中,2 d 后收集细胞。将约1 ×107个细胞溶解在加80 U/mL RNasin 的裂解缓冲液中。向每个结合反应管中加入50 μL ANTIstrep 磁珠并孵育4 h。在裂解缓冲液中洗涤珠子6次。随后使用Glycine-HCI (pH=2.0) 洗脱与HOTAIR 和与HOTAIR 相互作用的RNA。

1.9 RNA 抽取与实时荧光定量PCR

用TRIzol 试剂提取乳腺癌细胞的总RNA,在qRT-PCR 之前,用ReverTra Ace qPCR RT Kit 将200 ng 提取的RNA 逆转录为cDNA。使用THUNDERBIRD SYBR®qPCR Mix 和LightCycler 480 实时PCR 系统进行定量PCR。GAPDH和U6 基因用作内源对照基因,用于标准化靶基因的表达。一式三份分析每个样品。热循环程序包括在94 ℃保持2 min;然后是30 个循环,即94 ℃30 s、56 ℃30 s和72 ℃60 s。然后收集熔解曲线数据以验证PCR特异性和引物二聚体的存在。引物如下: HOTAIR正义链为5′-GGTAGAAAAAGCAACCACGA-AGC-3′,HOTAIR 反义链为 5′-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3′;miR-130a-3p 正义链为5′-CGCCGCAGTGCAATGTTAAA-3′,miR-130a-3p 反义链为5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′;ABCC5 正义链为5′-TTTTCAGGATGGCTGTATTCT-3′,ABCC5 反义链为5′-TGGCTTCTTTTCCAGTATGC-3′;GAPDH正义链为5′-GTCAGGATCCACTCATCACG-3′,GAPDH 反义链为5′-GATCGGACTTACGGACTCACATC-3′;U6 正义链为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,U6 反义链为5′-AACGCTTCACGAATTTGC-GT-3′。

1.10 免疫印迹

通过刮擦或使用非酶细胞解离液收获细胞,在PBS 中洗涤2 次。通过在蛋白质提取缓冲液中收获细胞制备总细胞裂解物,并使用BCA 蛋白质测定试剂盒分析蛋白质浓度。通过SDS-PAGE 分离等量的蛋白质,转移到聚偏二氟乙烯膜,用5 %脱脂牛奶在TBST (Tris 缓冲盐水,pH 7.4 和0.05 %Tween 20) 中封闭,并与抗ABCC5 和GAPDH 在4 ℃下过夜。探测膜的GAPDH 水平作为上样对照。接下来,将膜与碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG 在室温下孵育1 h。最后,使用具有化学发光底物的抗兔或抗小鼠碱性磷酸酶偶联二抗进行可视化。

1.11 荧光素酶报告实验

用100 ng 质粒和200 nmol/L miR-130a-3p mimics、ABCC5-3′UTR-WT 或ABCC5-3′UTR-MT 对照转染细胞(1 ×105个/mL)。2 d 后,用80 μL 1 ×Passive Lysis Buffer 裂解细胞,并通过双荧光素酶测定进行测试。通过双荧光素酶测定系统评估荧光素酶活性。

1.12 统计学分析

使用 GraphPad Prism 6.0 分析统计数据。Student’st检验用于评估个体组之间的差异。

2 结果

2.1 HOTAIR 在紫杉醇耐药乳腺癌细胞中高表达

筛选出乳腺癌紫杉醇抗性细胞系(MCF7/TR细胞),研究乳腺癌细胞中紫杉醇抗性的机制。将这些细胞暴露于紫杉醇中测试MCF7/TR 细胞以及亲代细胞的抗性。紫杉醇处理可以显著抑制亲本细胞的增殖和诱导细胞凋亡,但不能抑制抗性细胞(图1A、B)。紫杉醇处理可在MCF7 细胞中显著诱导G1期停滞,但在MCF7/TR 细胞中则不然(图1C)。这些数据表明,已成功筛选出紫杉醇抗性细胞(MCF7/TR 细胞)。同时,检测了MCF7/TR 细胞以及亲代细胞细胞群中LncRNA HOTAIR 的表达水平,发现MCF7/TR 细胞中HOTAIR 的表达量高于亲代细胞细胞群(图1D)。

图1 HOTAIR 在紫杉醇耐药乳腺癌细胞中高表达

2.2 HOTAIR 影响乳腺癌细胞紫杉醇耐药

敲低HOTAIR 后,紫杉醇处理可以显著抑制的MCF7/TR 细胞的增殖和诱导细胞凋亡,并且诱导MCF7/TR 细胞停滞于G1期(图2A～C)。

图2 HOTAIR 影响乳腺癌细胞紫杉醇耐药

与其亲代细胞相比,MCF7/TR 细胞内紫杉醇的浓度明显的降低,然而敲低HOTAIR 之后,MCF7/TR 细胞内紫杉醇的浓度明显的升高 (图2D)。

2.3 HOTAIR 调控miR-130a-3p 影响乳腺癌细胞紫杉醇耐药

将以下4 组MCF/TR 细胞进行转录组测序:①敲低对照组;②敲低HOTAIR 组;③转染纯化对照组;④转染Bio-HOTAIR 后纯化HOTAIR 相互作用RNA 组,同时满足敲低HOTAIR 后升高并且与HOTAIR 有相互作用的miRNA 有25 个 (图3A)。使用miRNA mimics 过表达上述25 个miRNA后,发现过表达miR-130a-3p 时MCF7/TR 细胞内紫杉醇浓度明显升高(图3B)。相比于亲代细胞细胞群,MCF7/TR 细胞中miR-130a-3p 表达水平降低(图3C)。并且使用实时荧光定量PCR 能够检测到miR-130a-3p 与HOTAIR 的相互作用 (图3C)。敲 低HOTAIR 后,MCF/TR 细胞中miR-130a-3p 的表达水平升高(图3C)。过表达miR-130a-3p 后,紫杉醇处理可以显著抑制的MCF7/TR细胞的增殖和诱导细胞凋亡,并且诱导MCF7/TR细胞停滞于G1期(图4A～C)。

图3 HOTAIR 对miR-130a-3p 的调控

图4 miR-130a-3p 影响乳腺癌细胞紫杉醇耐药

2.4 miR-130a-3p 调控ABCC5 影响乳腺癌细胞紫杉醇耐药

过表达或敲低miR-130a-3p 后MCF7/TR 细胞进行转录组测序,发现多种基因被调节(图5A)。使用过表达质粒过表达上述基因后,发现过表达ABCC5 时MCF7/TR 细胞内紫杉醇浓度明显升高(图5B)。同时,miR-130a-3p 可以靶向ABCC5 mRNA 的3′端非翻译区 (图5C)。过表达miR-130a-3p 后,ABCC5 的表达水平下降;敲低miR-130a-3p 后,ABCC5 的表达水平上升(图5D、图6A、B)。敲低ABCC5 后,紫杉醇处理可以显著抑制MCF7/TR 细胞的增殖和诱导细胞凋亡,并且诱导MCF7/TR 细胞停滞于G1期(图6C～E)。

图5 miR-130a-3p 对ABCC5 的调控

图6 ABCC5 影响乳腺癌细胞紫杉醇耐药

3 讨论

越来越多的研究发现,LncRNA 和miRNA 的异常表达可能通过调节某些靶点而在各种人类癌细胞的紫杉醇敏感性中起重要作用。本研究发现LncRNA HOTAIR 通过miR-130a-3p/ABCC5 轴减少了紫杉醇耐药细胞中紫杉醇细胞内水平,促进了乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药。HOTAIR-miR-130a-3p 的相互作用促进ABCC5 表达所致的紫杉醇耐药,可能在乳腺癌的治疗中具有巨大的潜力。

紫杉醇是一类紫杉烷类药物,是许多癌症中广泛使用的化学治疗剂,然而肿瘤细胞对紫杉醇药物产生的耐药性是临床上应用紫杉醇治疗BC 的一个主要障碍[11]。导致这种耐药性现象的几种机制包括非编码RNA 调控的影响等[12-13]。本研究通过紫杉醇连续处理多代MCF7 细胞获得了MCF7/TR 细胞,并发现MCF7/TR 细胞中HOTAIR 的表达量高于亲代细胞。与其亲代细胞相比,MCF7/TR 细胞内紫杉醇浓度明显降低,而敲低HOTAIR 后MCF7/TR 细胞内紫杉醇浓度升高。因此,HOTAIR可能通过减少紫杉醇的胞内转运或者增加紫杉醇的胞外转运来帮助BC 抵抗紫杉醇治疗。

LncRNA 定位于细胞质或细胞核中,可以与miRNA、mRNA、RNA 结合蛋白相互作用并调控生理功能(包括肿瘤细胞的耐药性)[14-17]。本研究发现miR-130a-3p 与HOTAIR 存在相互作用。miRNA通常与目标mRNA 的3′UTR 碱基配对,从而减少mRNA 的翻译或引起mRNA 转录物的降解[18-21]。本研究发现miR-130a-3p 可以靶向ABCC5 mRNA的3′端非翻译区。过表达ABCC5 时MCF7/TR 细胞内紫杉醇浓度明显升高。ABCC5 是ABC 超家族的一员,也是一种ATP 依赖性转运蛋白,与治疗乳腺癌的药物培美曲塞的化疗耐药性显著相关[22]。在耐药癌细胞中,存在药物外排泵蛋白的过表达,该蛋白由ATP 结合盒 (ABC) 超家族成员组成[23]。ABCC5 可能是通过增加紫杉醇由胞内向胞外的转运而减少了胞内紫杉醇的浓度,从而促进BC 对紫杉醇的耐药性。研究发现,Circ_ 0007031通过调节miR-133b/ABCC5 轴增强肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性[24-25]。因此,ABCC5 可能是多种肿瘤细胞对不同方案化疗耐药性的关键因子。此外,LncRNA-miRNA 的相互作用通过沉默靶蛋白编码基因来引发致癌或抑癌功能,在乳腺癌的治疗中具有巨大的潜力。