丙泊酚通过SFRP1-Wnt 信号通路抑制肠癌细胞增殖侵袭的机制研究

梁伟华,蒋淼

上海市宝山区仁和医院(复旦大学附属华山医院北院宝山分院) 麻醉科 上海市,200431

结直肠癌为消化道常见肿瘤之一[1]。由于其起病隐匿,患者就诊已为中晚期,当前手术结合放化疗的综合治疗疗效仍然不佳、预后也不理想[2]。据报道结直肠癌晚期患者的5 年生存率仅为13.1 %[3];因此,探究结直肠癌发生的致病机理,挖掘相关干预靶点成为临床亟待解决的问题。丙泊酚(Propofol) 为临床手术常用麻醉剂。近年研究发现,丙泊酚除了具有麻醉效果外,还具备抗焦虑、神经保护、抗氧化、免疫调节以及抗肿瘤活性[4-7]。已有多篇文献报道丙泊酚可抑制肿瘤增殖和转移[8-10],但对结直肠癌细胞作用报道不多。

Wnt/β-catenin 信号通路为结直肠癌发生、发展的驱动信号通路。最新研究发现Wnt 上游抑制因子分泌卷曲相关蛋白1 (secreted frizzled-related protein 1,SFRP1) 可因Zeste 同源2 增强子(enhancer of Zeste homologue 2,EZH2) 介导的组蛋白3 甲基化修饰导致表观沉默,从而活化Wnt/β-catenin 信号通路[11-14]。有证据表明丙泊酚在脂肪干细胞、肺癌细胞 中可阻断Wnt/β-catenin 信号 通路[15-16],但在结直肠癌中是否存在此效应尚不明确。本研究拟明确丙泊酚对肠癌细胞增殖和侵袭的抑制作用,揭示丙泊酚对Wnt/β-catenin 信号通路调节机制,为丙泊酚的抗肿瘤活性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

结直肠癌细胞SW620 和HT29 购自ATCC。丙泊酚购自Sigma Aldrich 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组 结直肠癌细胞SW620 和HT29 购自ATCC。采用含100 U/mL 青霉素、100 U/ml 链霉素和10 %胎牛血清的DMEM培养基,置于37 ℃,含5 % CO2且湿度饱和的培养箱中培养。将细胞分为对照组(为生理盐水)和丙泊酚组(其工作终浓为10 μg/mL)。

1.2.2 细胞增殖试验(CCK-8) 将SW620 细胞和HT29 细胞制成单细胞悬液,分别接种于96 孔板,每孔1 000 个细胞,将接种好的96 孔板放入培养箱中。待24 h 细胞贴壁后,对照组及丙泊酚组各孔内更换对照及含丙泊酚培养液,并于加药时、加药24、48 和72 h 将10 %的CCK-8 试剂加入待检测孔中,37 ℃孵育4 h,每个时间点设置6个复孔。采用酶标仪检测各时间点各孔的吸光度(A450nm)。

1.2.3 细胞划痕实验 于6 孔板培养各组细胞(1.0 ×105个/孔) 12 h,弃培养液,于底部划线,除去划痕间细胞,测量划痕间距(d),记为d0h。培养48 h 后,再次测量,记为d48h。划痕愈合率(%)=(d0h-d48h)/d0h×100 %。

(1) 工程案例一。案例引自文献[9]，滑坡体为黏土和粉质黏土为主夹杂碎石，坡体倾斜度为20°，土体重度γ=18 kN/m3，土体抗剪强度参数c=130 kPa，φ=15°，抗滑桩截面尺寸a=2 m，b=3 m，抗滑桩受荷段长H=10.5 m。由不平衡荷载传递系数法计算出抗滑桩处的设计滑坡体推力为1 076.6 kN/m。

县级思想宣传机构发展缓慢，更有甚者举步维艰，公众阅读习惯的改变使得县级传统媒体快速流失用户，受到新媒体猛烈的打击。短视频可谓是更为彻底的手机原生态产品，流量大规模从传统媒体倾泻般涌入短视频，俨然已是当今无可辩驳的事实。同时，可以预见的是，2020年5G大规模商用之后，用户观看视频时长还将大幅度上升，大概率会出现视频APP使用时间多于社交通信APP的情况，而社交通信类APP也面临视频化和三维化的发展压力。基于此，短视频建设将是县级融媒体建设不可或缺的战略重镇。

1.2.6 染色质免疫沉淀-定量PCR (ChIP-qPCR) 按厂家说明书进行操作,通过DNA 与蛋白质交联、酶处理消化染色质为小片段、利用EZH2 及H3K27Me3 抗体将与目的蛋白相结合的DNA 片段沉淀下来,再通过洗脱、解交联及纯化DNA,利用qPCR 检测EZH2 及H3K27Me3 沉淀DNA 中靶基因的含量。

1.2.5 逆转录实时荧光定量PCR 按总RNA 提取、逆转录及荧光定量PCR 按试剂盒说明书操作。Real-time 定量PCR 条件为: 95 ℃10 min 后,95 ℃15 s,60 ℃1 min,40 个循环。Real-time 定量PCR使用ABI 7500 仪器进行。根据待测标本的Ct 值,以GAPDH 作为内参照,采用2-△△Ct法计算相对表达倍数变化。各引物如下: E-cadherin 正义链为5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′,反义链为 5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′;N-cadherin 正义链为5′-TGCGGTACAGTGTAACTGGG-3′,反义链为5′-GAAACCGGGCTATCTGCTCG-3′;β-catenin 正义链为5′-AGCTTCCAGACACGCTATCAT-3′,反义链为5′-CGGTACAACGAGCTGTTTCTAC-3′;c-Myc正义链为5′-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA-3′,反义链为5′-CTGCGTAGTTGTGCTGATGT-3′;CyclinD1正义链为5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′,反义链为5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′;SFRP1正义链为5′-ACGTGGGCTACAAGAAGATGG-3′,反义链为5′-CAGCGACACGGGTAGATGG-3′。

数据报出率：共送样6596件，报出项目数91802个，未报出项目数542个，各元素的报出率均在97.86%～100%之间。

1.3 统计学方法

细胞划痕实验表明,丙泊酚组细胞迁移愈合面积显著低于对照组(P＜0.01),提示丙泊酚抑制细胞迁移运动能力(图1)。Tranwell 小室实验发现,丙泊酚组穿膜细胞数量显著低于对照组(P＜0.01),提示丙泊酚抑制细胞侵袭能力(图2)。

2 结果

2.1 丙泊酚抑制肠癌细胞增殖

CCK-8 细胞增殖试验表明: 肠癌细胞SW620及HT29 丙泊酚处理24 h 后,丙泊酚组增殖活性显著低于对照组细胞(表1,P＜0.0001)。

1.2.4 Transwell 小室试验 肠癌细胞制成单细胞悬液并调整浓度至5 ×104个/mL 接种于Transwell小室(铺有Matrigel 胶),下室加入正常含胎牛血清完全培养基700 μL,培养48 h 后取出小室。预冷甲醇,固定10 min,在PBS 中用棉签刮去小室上层细胞后,进行结晶紫染色,ddH2O 清洗。倒置显微镜取3 个视野,计数取均值。

表1 丙泊酚组和对照组细胞增殖活性(A450nm) 的比较(n=6)

2.2 丙泊酚抑制肠癌细胞转移与侵袭

采用SPSS 17.0 统计软件比较不同组别间的差异,2 组独立样本间比较采用独立样本t检验。取P＜0.05 为假设检验有统计学意义的标准。

图1 对照组与丙泊酚组肠癌细胞划痕愈合能力比较(×100)

图2 对照组与丙泊酚组肠癌细胞侵袭能力比较(×200)

2.3 丙泊酚抑制肠癌细胞Wnt 信号通路相关基因表达

随着时代的发展，马克思主义思想中的生态哲学愈来愈得到人们的重视。曾繁仁的生态美学思想就是继承发展了马克思恩格斯唯物实践存在论中的生态理论。通过对马克思恩格斯创立的实践观的研究，证明了其是一种富有革命精神的生态人文主义，具有浓郁的生态内涵，因此我们把它作为现阶段建设生态观和生态审美观的理论基础是完全可行的。

图3 对照组及丙泊酚组Wnt 信号通路相关基因表达比较

表2 对照组及丙泊酚组Wnt 信号通路相关基因表达比较(n=3)

2.4 丙泊酚减弱EZH2 对SFRP1 抑制效应

利用ChIP-qPCR 方法,我们检测了对照组细胞和丙泊酚组细胞中,EZH2、H3K27Me3 于SFRP1 启动子富集程度的变化。如表3 所示,丙泊酚组SW620 及HT29 细胞的EZH2、H3K27Me3 在SFRP1 启动子富集程度显著低于对照组细胞(P＜0.01),上述结果提示EZH2 对SFRP1 转录抑制作用减弱。

我们利用qPCR 检测对照组及丙泊酚组细胞Wnt 信号通路相关基因表达变化,如表2、图3 所示,丙泊酚组肠癌细胞较对照组,E-cadherin 显著上调(P＜0.0001),而N-cadherin 表达减低(P＜0.0001),提示丙泊酚促进了肠癌细胞上皮间充质转化。同时,Wnt 信号通路靶基因β-catenin、c-Myc及CyclinD1 与对照组比较明显下调 (P＜0.0001)。Wnt 信号通路上的抑制因子SFRP1 表达显著上调(P＜0.0001)。

表3 对照组及丙泊酚组EZH2、H3K27Me3 在SFRP1 启动子富集程度比较(n=3)

3 讨论

结直肠癌为消化系统常见的恶性肿瘤之一,手术仍为主要治疗手段。研究发现挥发性吸入性麻醉剂可促进机体进入炎症状态,增加动物小鼠及人发生癌转移的概率[17],相比之下,丙泊酚通过抗炎、抗氧化等作用抑制肿瘤生长,减少转移风险[18-19]。临床研究已发现丙泊酚与吸入性麻醉剂相比可减少肿瘤复发和患者死亡率[20-21]。本研究发现,丙泊酚对结直肠癌细胞具有直接抑制作用。与对照组比较,丙泊酚可以直接抑制肠癌细胞SW620 及HT29增殖活性,在作用24 h 即出现明显抑制现象。此外,细胞划痕实验及Transwell 小室试验表明丙泊酚对肠癌细胞运动迁移和侵袭有抑制作用,表明丙泊酚具备抑制肠癌细胞增殖和侵袭的抗肿瘤功能。

鉴于Wnt 信号通路为结直肠癌发生、发展的驱动信号通路,我们利用qPCR 分析丙泊酚是否影响Wnt 信号通路活性。Wnt 信号通路激活往往伴随着上皮间充质转换(EMT),从而增强肿瘤细胞转移和侵袭能力[22-24]。我们发现丙泊酚组细胞较对照组E-cadherin 表达显著上调,N-cadherin 减弱,表明丙泊酚可减弱肠癌细胞发生EMT 能力,与我们的细胞划痕实验和Tranwell 小室结果相符。同时,我们检测了丙泊酚处理细胞后Wnt 信号通路经典下游靶基因β-catenin、c-Myc及CyclinD1,结果表明丙泊酚组细胞上述3 基因均有不同程度下调。其中c-Myc可抑制细胞凋亡,而周期蛋白Cyclin D1 促进细胞G1/S 期转换,均与细胞增殖活性有关[25-26]。我们的体外CCK-8 实验也证实了丙泊酚作用肠癌细胞后增殖活性明显低于对照组细胞。本研究发现的丙泊酚新靶点Wnt 信号通路尚未见类似报道,丰富了丙泊酚作为抗肿瘤的作用机制。

近年来,大量研究表明SFRP1 是Wnt 信号通路表面受体拮抗剂,通过竞争抑制Wnt 配体与受体结合,增加β-catenin 磷酸化水平,降低细胞内β-catenin 水平[27-28]。本研究发现丙泊酚可以诱导SFRP1 上调,提示了丙泊酚可能通过增强SFRP1 表达水平抑制Wnt 信号通路。最新研究表明SFRP1 可因EZH2 在其启动子富集程度增加后催化组蛋白3 第27位赖氨酸发生三甲基化(H3K27Me27),导致其启动子染色质构象改变,从而实现转录抑制[11-14]。我们推测丙泊酚可能通过影响SFRP1 的启动子对EZH2 的招募,诱导SFRP1 的表达。利用染色质免疫沉淀技术,我们发现丙泊酚组细胞较对照组细胞EZH2 在SFRP1 启动子富集程度显著下降,同时H3K27Me27 形式组蛋白在启动子富集度也明显降低,证明了丙泊酚可通过抑制EZH2 介导SFRP1 启动子表观机制,诱导其表达上调,从而抑制Wnt信号通路活化。本研究首次从SFRP1 表观调控角度揭示了丙泊酚抗癌作用,具有重要临床价值。

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综上所述,本研究发现丙泊酚具有抑制肠癌细胞增殖和侵袭活性。丙泊酚通过减弱EZH2 对SFRP1 表观沉默作用,诱导其表达上调,从而减低Wnt 信号通路活性,抑制肠癌细胞恶性生物学表型。本研究丰富了丙泊酚抗癌作用理论,为其成为潜在抗癌药物提供了实验依据。