UHPLC-MS/MS 法同时测定壮骨关节胶囊中19 种成分

马志会，成丽媛，张 玥，3，周 昆，3*

（1.晋城大医院，山西 晋城 048006； 2.天津中医药大学中医药研究院，天津 301617； 3.天津中医药大学组分中药国家重点实验室，天津 301617）

壮骨关节胶囊由熟地黄、淫羊藿、补骨脂、骨碎补、续断、桑寄生、狗脊、乳香、没药、鸡血藤、独活、木香12 味中药组成［1］，具有舒经活络、养血活血、理气止痛功效，临床常用于治疗气滞血瘀、肝肾不足、经络痹阻所致的退行性骨关节病、腰肌劳损等疾病［2-4］。

目前，对壮骨关节胶囊的研究大多为临床、药效方面［5-8］，鲜有涉及含量测定［9-10］，并且主要是采用HPLC 法分析单一成分（如补骨脂素等），缺少多种成分全面检测。因此，本实验建立UHPLCMS/MS 法同时测定壮骨关节胶囊中毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川续断皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、新补骨脂异黄酮、刺芒柄花素、二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素的含量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 TripleQuad 4500 型高效液相色谱-串联质谱仪（美国AB SCIEX 公司）； LD-30A UHPLC超高效液相色谱仪（日本岛津公司）； Legend Micro 21R 低温高速离心机（美国Thermo 公司）； XS204电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； SK5200Hp 超声波清洗器 （上海科导超声仪器有限公司）；Integral 5 纯水机（美国密理博公司）； Concentrator plus 真空浓缩仪（德国Eppendorf 公司）。

1.2 试剂与药物 毛蕊花糖苷（批号19082201）、淫羊藿苷 （批号18012906）、朝藿定A （批号17022003）、柚皮苷（批号18032101）、川续断皂苷Ⅵ （ 批号 19121901 ）、槲皮素 （ 批号19082203）、槲皮苷（批号19091104）、异槲皮苷（批号18082901）、补骨脂素 （批号19101703）、异补骨脂素（批号19101704）、补骨脂酚（批号18041103）、补骨脂甲素（批号16110701）、补骨脂乙素（批号16061203）、新补骨脂异黄酮（批号16091201）、刺芒柄花素（批号18032702）、二氢欧山芹醇当归酸酯（批号19091001）、蛇床子素（批号16061303） 对照品均购自成都普菲德生物科技有限公司，纯度均≥98%； 朝藿定B （批号MUST-16071403）、朝藿定 C （ 批号 MUST-16070705） 对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度均≥98%。

壮骨关节胶囊共7 批，购自华润三九医药股份有限公司，编号S1 （批号1908001S）、S2 （批号1909001S）、S3 （批号 1909002S）、S4 （批号1909003S）、S5 （批号 1909004S）、S6 （批号1909005S）、S7 （批号1909006S）。

甲醇、乙腈为色谱纯，购自德国Merck 公司；乙酸乙酯为分析纯，购自天津市汇杭化工科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 UHPLC-MS/MS 分析条件

2.1.1 色谱 Hypersil GOLD Selectivity C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）； 流动相0.1% 甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0 ～1 min，5% ～12%B； 1～3 min，12% ～25%B； 3 ～7 min，25% ～36%B； 7～8 min，36% B； 8 ～11 min，36% ～56% B；11～13 min，56% ～60% B； 13 ～16 min，60% B；16～17 min，60% ～78% B，17 ～18 min，78% B；18～20 min，78% ～5%B； 20 ～22 min，5%B）； 体积流量0.2 mL/min； 柱温40 ℃； 进样量3 μL。

2.1.2 质谱 电喷雾离子源（ESI）； 正负离子扫描； 多反应监测 （MRM） 模式； 离子喷雾电压±4 500 V； 源温度500 ℃； GAS I、GASⅡ、气帘气压力40、50、10 psi （1 psi ＝6.895 kPa），其他主要质谱参数见表1。

表1 各成分主要质谱参数Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇制成质量浓度均为1 mg/mL的溶液，即得，置于4 ℃冰箱中保存。

2.2.2 供试品溶液 精密称定本品内容物0.2 g，置于25 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，称定质量，密封超声提取30 min，取出，放冷至室温，甲醇补足减失的质量，取上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，甲醇稀释20 倍，即得，在4 ℃下保存。检测前精密吸取100 μL，挥干后加100 μL 50% 乙腈复溶。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取对照品、供试品溶液适量，在“2.1” 项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱柱在相应保留时间处无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分UHPLC-MS/MS 色谱图Fig.1 UHPLC-MS/MS chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，甲醇稀释成7 个质量浓度，取适量混合，精密吸取100 μL 后挥干，加100 μL 50%乙腈复溶，在“2.1” 项条件下进样测定。以对照品峰面积（Y） 对其质量浓度（X） 进行回归，并以S/N≥3 为检测限，S/N≥10 为定量限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液适量，在“2.1” 项条件下进样测定6 次，测得毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川续断皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、新补骨脂异黄酮、刺芒柄花素、二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素含量RSD 分别为1.75%、1.59%、0.74%、1.15%、1.13%、1.69%、1.48%、1.59%、1.87%、1.97%、1.85%、1.53%、1.18%、1.79%、1.55%、1.71%、1.76%、1.79%、1.70%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 精密吸取同一批本品（S5），按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项条件下进样测定，测得毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川续断皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、新补骨脂异黄酮、刺芒柄花素、二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素含量RSD 分别为1.67%、0.67%、1.84%、1.78%、1.83%、0.94%、1.54%、1.66%、1.62%、1.27%、1.57%、1.66%、1.96%、1.64%、1.55%、1.53%、1.41%、1.51%、1.96%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 精密吸取同一批本品（S5），按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，于0、6、24 h 在“2.1” 项条件下进样测定，测得毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川续断皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、新补骨脂异黄酮、刺芒柄花素、二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素含量RSD 分别为2.96%、3.78%、2.17%、4.17%、3.97%、4.29%、3.14%、1.81%、2.82%、2.42%、3.16%、1.51%、2.06%、4.12%、3.40%、2.39%、0.96%、2.27%、2.94%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的同一批本品（S5） 0.1 g，加入等量对照品，按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项条件下进样测定，计算回收率。结果，毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川续断皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、新补骨脂异黄酮、刺芒柄花素、二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素平均加样回收率分别为99.34%、101.78%、98.55%、100.22%、99.97%、101.24%、100.56%、98.89%、99.59%、102.01%、99.35%、99.89%、99.18%、100.24%、100.08%、99.59%、101.44%、99.94%、101.32%，RSD 分别为1.44%、0.99%、1.45%、1.36%、2.06%、1.89%、2.89%、1.68%、2.10%、1.69%、1.80%、1.58%、1.99%、0.98%、2.44%、3.32%、1.65%、2.38%、1.87%。

2.4 样品含量测定 取7 批样品，按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，分别精密吸取100 μL，在“2.1” 项条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（mg/g，n＝6）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg/g，n＝6）

3 讨论

本实验首先考察了不同体积分数 （50%、70%、100%） 甲醇的提取效果，发现甲醇提取时各成分色谱峰峰形稳定，响应值高，故选择其作为提取溶剂。再考察了以水-乙腈洗脱时各成分色谱行为，发现个别色谱峰峰形响应值较低，故在水相中加入0.1%甲酸，此时大多数峰形有所改善，响应值更高，故选择0.1%甲酸-乙腈作为流动相。

含量测定结果显示，各成分含量总体上较稳定，与文献［10-17］ 报道一致，但个别成分存在一定差异，这可能与所用药材产地、批次有关，其中补骨脂所含成分补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、新补骨脂异黄酮含量在S1～S4 批次样品中较稳定，而在S5 ～S7 批次样品中明显更高，并且补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚差异较大。大量研究表明，不同产地补骨脂中有效成分补骨脂素、异补骨脂素含量存在差异［18-20］，故应考虑其产地、批次、采收时间等因素以减小批间差异。

4 结论

本实验建立UHPLC-MS/MS 法同时测定壮骨关节胶囊中毛蕊花糖苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、柚皮苷、川续断皂苷Ⅵ、槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、新补骨脂异黄酮、刺芒柄花素、二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素的含量，该方法精密度、重复性、稳定性良好，符合分析要求，可为该制剂质量控制提供参考。