HPLC法测定补骨脂药材中补骨脂素和异补骨脂素

李俊娟， 李 军

(1.伊川中医院，河南洛阳 471300;2.北京中医药大学中药现代研究中心，北京 100029)

补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果实。具有温肾助阳，温脾止泻的功效。现代药理研究表明补骨脂具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、增强免疫等多种药理活性［1］。补骨脂中的主要化学成分为香豆素和黄酮类化合物［2-5］，其中所含的呋喃香豆素类成分补骨脂素(psoralen)及异补骨脂素 (isopsoralen)为补骨脂的主要有效成分，研究表明其对小鼠肉瘤、艾氏腹水瘤等多种瘤细胞的生长具有显著的抑制作用［6-7］。虽然对含补骨脂素和异补骨脂素中成药中两种成分定量测定的方法研究较多，但利用HPLC法对补骨脂原药材中补骨脂素和异补骨脂素的定量测定方法研究的比较少［8-12］。本实验利用HPLC法对补骨脂药材中的补骨脂素及异补骨脂素的定量测定方法进行了系统的研究。

1 仪器及试剂

1.1 仪器及试剂 Waters 600 HPLC色谱系统:waters 717自动进样器、真空脱气、四元梯度泵、柱温箱;2996 DAD检测器;Alltima C18高效液相色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)。BP110S电子分析天平;超声波清洗器;补骨脂素和异补骨脂素对照品购自中国生物制品药品检定所 (批号分别为:07399907;07389907)，纯度利用HPLC面积归一化法测定大于98.0%，甲醇为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂为分析纯。

1.2 药材 10批药材分别采自河南、陕西、重庆、四川等地和购于香港药材市场，经伊川中医院李俊娟主管药师鉴定为豆科植物补骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Alltima C18高效液相色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-水 (50∶50);体积流量1.0 mL/min;柱温25℃;检测波长246 nm;进样量20 μL。

2.2 对照品溶液的制备 精密称定补骨脂素、异补骨脂素对照品2.5 mg，置于5 mL量瓶中，甲醇溶解，用甲醇稀释至刻度，制备成0.5 mg/mL的标准贮备液，避光放置备用。

2.3 检出限的测定 精密吸取补骨脂素和异补骨脂素对照品贮备液适量，进行梯度稀释后，精密吸取各稀释液20 μL进行分析，以信噪比不小于3∶1为标准，测定补骨脂素的检出限为0.065 ng/mL，异补骨脂素的检出限为0.053 ng/mL。

2.4 定量限的测定 精密吸取补骨脂素和异补骨脂素对照品贮备液适量，进行梯度稀释后，精密吸取各稀释液10 μL进行分析，以信噪比不小于10∶1为标准，测定补骨脂素的定量限为0.145 ng/mL，异补骨脂素的定量限为0.127 ng/mL。

2.5 线性关系考察 分别精密吸取4.0 mL补骨脂素、异补骨脂素对照品贮备液于10 mL量瓶中，加入甲醇定容，混匀，制备成质量浓度为0.2 mg/mL的混合对照品贮备液，精密吸取混合对照品贮备液50、200、300、500、750 μL，置于1 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制备成分别含补骨脂素、异补骨脂素为0.01、0.04、0.06、0.10、0.15 mg/mL的混合对照品溶液，精密吸取对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪进行分析，以峰面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标作图，结果表明补骨脂素、异补骨脂素在0.010～0.150 mg/mL范围内线性良好。回归方程分别为:补骨脂素，y=78 335x-169 974(r2=0.999 6);异补骨脂素，y=74 076x-123 199(r2=0.999 3)。

2.6 提取方法考察 精密称取4份粉碎后的补骨脂药材0.3 g，加入适量甲醇，分别加热回流提取1.5 h，索氏回流提取4 h，冷浸提取12 h和超声提取30 min(2次)，提取液减压蒸干溶剂，残渣用甲醇溶解转移至50 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度。各提取液经0.45 μm滤膜滤过，精密吸取续滤液20 μL，注入液相色谱仪进行分析，以补骨脂素和异补骨脂素为考察指标，结果表明超声提取法对补骨脂素和异补骨脂素的提取效率佳，并且方法简单快捷，故选用超声提取法进行提取。

2.7 提取溶剂考察 精密称取5份粉碎后的补骨脂药材0.3 g，分别加入甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇和水20 mL，超声提取30 min后，4 500 r/min离心5 min，上清液转移至50 mL的量瓶中。药渣用相应溶剂重复提取一次，合并上清液于50 mL量瓶中，用相应溶剂进行稀释至刻度。各提取液经0.45 μm滤膜滤过，精密吸取续滤液20 μL，注入液相色谱仪进行分析，以补骨脂素和异补骨脂素为考察指标，结果表明50%甲醇对补骨脂素和异补骨脂素的提取效率最佳。

2.8 样品溶液的制备 精密称取粉碎后的补骨脂药材0.3 g，加入50%甲醇20 mL，进行超声提取30 min后，4 500 r/min条件下离心5 min，上清液转移至50 mL的量瓶中。药渣同法重复提取一次，合并上清液于50 mL量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，混匀。提取液经0.45 μm滤膜滤过，精密吸取续滤液20 μL，注入液相色谱仪进行分析。

2.9 精密度考察 精密吸取混合对照品溶液 (60 mg/L)20 μL，注入液相色谱仪，重复分析5次，以补骨脂素和异补骨脂素的峰面积为考察指标，补骨脂素和异补骨脂素的RSD分别为1.32%和1.38%。

2.10 稳定性考察 精密称取采集于河南新乡的补骨脂药材0.3 g，按照样品溶液制备项下制备样品溶液，精密吸取样品溶液20 μL，分别于0、2、4、8、12、24 h测定，以补骨脂素和异补骨脂素的峰面积为指标，计算RSD分别为1.37%和1.42%，表明样品溶液在24 h内测定稳定。

2.11 重复性考察 精密称取6份采集于河南新乡的补骨脂药材0.3 g，按照样品溶液制备项下制备、进样20 μL，记录补骨脂素和异补骨脂素的峰面积值，计算补骨脂素和异补骨脂素的质量分数，RSD分别为0.41%和1.23%。

2.12 加样回收率考察 精密称取6份采集于河南新乡的补骨脂药材0.3 g，分别精密加入对照品补骨脂素和异补骨脂素各2.8 mg，按照样品溶液制备项下制备，依法测定。计算补骨脂素和异补骨脂素的平均回收率分别为97.8%和103.1%，RSD分别为0.89%和1.13%。

2.13 样品测定 精密称取不同来源的补骨脂药材0.3 g各3份，按照样品溶液制备项下制备，测定补骨脂素和异补骨脂素，测定结果见表1，分析色谱图见图1。

图1 对照品溶液 (A)和样品溶液 (B)HPLC色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed reference substanles(A)and Psoraleae Fructus extract

表1 不同来源补骨脂药材测定结果Tab.1 Contents of psoralen and isopsoralen in Psoraleae Fructus from different sources

3 小结与讨论

补骨脂为临床常用中药材，补骨脂素和异补骨脂素为其主要的活性成分，利用HPLC法对其中的补骨脂素和异补骨脂素进行测定，以前文献报道利用甲醇为溶剂，超声提取法提取效果最佳［9］;也有报道利用50%甲醇为溶剂，冷浸法提取效果最佳［13］。本实验通过对不同比例含水甲醇作为溶剂的提取效率进行了考察，发现50%甲醇为溶剂，超声提取30 min(两次)能够将药材中的补骨脂素和异补骨脂素提取完全。对于分析流动相的选择，文献报道中利用甲醇-酸水为流动相，才能达到理想的分离效果［12］。本实验选用50%甲醇水为流动相，等度洗脱，在保留时间15～20 min间，补骨脂素和异补骨脂素就达到了理想分离，分析周期短，分离度好。本实验通过对提取方法、提取溶剂、检测限和定量限等指标参数的详细考察，建立了快速分析补骨脂药材中补骨脂素和异补骨脂素含有量的方法，该方法具有灵敏度高、可重复性强、回收率佳等特点，为补骨脂药材及成药的质量控制和临床用药的安全有效提供了必要的参考。

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