复方板蓝根颗粒物质基础研究及其整体质量评价

胡 青，程益清，曹 帅，孙 健，季 申*

（1.中国医药工业研究总院，上海 201203； 2.上海市食品药品检验研究院，国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室，上海 201203）

复方板蓝根颗粒收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》 中药成方制剂第十二册 （编号WS3-B-2377-97），由板蓝根、大青叶经水提醇沉工艺制得，用于治疗风热感冒、咽喉肿痛，可能通过多途径、多靶点干预来COVID-19［1］。查询国家药监局网站发现，现有复方板蓝根颗粒生产企业147家，批准文号151 个，质量标准17 个，其中1 个部颁标准仅收载了2 项理化鉴别项，无薄层鉴别、含量测定项目，而其余16 个国家标准增加了靛玉红等成分的TLC 鉴别或含量测定项目，故存在较严重的“不同标准” 情况，导致质量控制水平落后，市售产品质量参差不齐。

目前，关于复方板蓝根颗粒物质基础的文献较少［2-3］，而涉及质量标准的也集中于中靛玉红、尿苷等1～4 种成分的控制［4-6］，无法全面反映该制剂整体质量。因此，本实验采用UPLC-Q-TOF-MS 法对复方板蓝根颗粒进行物质基础研究、整体质量评价，以期为进一步提高其质量标准提供方向。

1 材料

Waters VION IMS Q-TOF 型液相质谱联用仪（美国Waters 公司）； Milli-Q Gradient A10 型纯水仪（美国Millipore 公司）； 电子分析天平（德国Sartorius 公司）； 超声仪； 离心机。板蓝根（批号121177-201608）、大青叶 （批号121367-200401）对照药材及靛玉红（批号110717-201805）、（R，S） -告依春（批号111753-202007）、鸟苷（批号111977-201501）、腺苷（批号110879-201703）、尿苷（批号110887-201803）、酪氨酸（批号140624-201506）、苯丙氨酸（批号140624-201506）、牡荆苷（批号111687-200501）、柠檬酸（批号111679-200401）、紫丁香苷（批号111574-200201） 对照品均购自中国食品药品检定研究院； 靛苷（批号M06A11K120647 ）、3-吲哚甲醛（批号H24A9Z59589）、落叶松树脂醇 B （ 批号T06A11Z120554 ）、异金雀花素（批号P07A11S120560）、异落叶松树脂醇 （ 批号Y28J11H116890） 对照品均购自上海源叶生物科技有限公司； 2，4-喹唑啉二酮对照品 （批号20191130） 购自上海沃凯生物技术有限公司。复方板蓝根颗粒共112 批，来自50 家企业（Q1 ～Q50）。乙腈、甲酸为色谱纯（德国Merck 公司）；水为超纯水。

2 方法

2.1 UPLC-Q-TOF-MS 分析条件

2.1.1 色谱 Waters HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0 ～1 min，100% B； 1 ～6 min，100% ～80%B； 6～18 min，80% ～35%B； 18 ～18.5 min，35% B ～0； 18.5 ～19.5 min，0； 19.5 ～23 min，0 ～100% B）； 体积流量0.5 mL/min； 柱温40 ℃； 进样量2 μL。

2.1.2 质谱 电喷雾离子源（ESI）； 负离子扫描； 毛细管电压2.5 kV； 锥孔电压40 V； 除溶剂气氮气，体积流量800 L/h； 除溶剂温度550 ℃；离子源温度120 ℃； 扫描范围m/z50 ～1 000； 扫描时间0.2 s； 碰撞气氮气，低能量扫描时碰撞能量4 eV，高能量扫描时碰撞能量25 ～60 eV。以50 pg/μL 亮氨酸-脑啡肽溶液为校正标准液。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，甲醇制成质量浓度均为20 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取112 批样品，每批各约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入10 mL甲醇，密塞，称定质量，超声 （功率250 W，频率40 kHz，40 ℃以下） 处理1 h，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，4 000 r/min 离心5 min，取上清液，即得。

2.3 数据处理与分析 采用UNIFI 软件采集数据，对于有对照品的成分，通过比对两者保留时间、质谱碎片特征进行鉴定； 对于没有对照品的成分，查阅中英文相关文献，收集已报道组方药材中的成分信息，包括名称、分子式、CAS 号、化学结构等，建立初步化学成分数据库，将UNIFI 软件与其进行自动匹配，质量数偏差设置为±5×10-6，并根据化合物二级质谱信息进行人工确认。

3 结果

3.1 成分鉴定 基峰离子流色谱图见图1，共检测到37 种主要成分［7-15］，包括8 种生物碱、7 种苯丙素、3 种核苷、2 种氨基酸、6 种有机酸、4 种黄酮、1 种含硫成分、6 种其他成分，具体见表1。以峰5、7、15、19、20、24 为例，对其鉴定过程进行分析。

表1 复方板蓝根颗粒化学成分鉴定结果Tab.1 Results of chemical constituent identification in Compound Banlangen Granules

图1 复方板蓝根颗粒基峰离子流色谱图Fig.1 Base peak ion current chromatogram of Compound Banlangen Granules

峰5 准分子离子峰m/z282.084 0 ［M-H］-，保留时间3.66 min，分子式C10H13N5O5； 二级质谱图中碎片离子为脱去一分子核糖后生成的m/z150.042 4 ［M-H-rib］-，通过比对对照品、查阅文献［7］、匹配数据库，推测该化合物为鸟苷，属于核苷类成分。

峰7 准分子离子峰m/z164.071 7 ［M-H］-，保留时间4.27 min，分子式C9H11NO2； 二级质谱图中碎片离子主要有m/z147.044 4 ［M-H-NH3］-、103.054 1 ［M-H-CO2-NH3］-，通过比对对照品、查阅文献［7］、匹配数据库，推测该化合物为苯丙氨酸，属于氨基酸类成分。

峰15 准分子离子峰m/z294.098 1 ［M-H］-，保留时间6.09 min，分子式C14H17NO6； 二级质谱图中碎片离子为脱去一分子葡萄糖后生成的m/z131.037 2 ［M-H-Glc-H］-，通过比对对照品、查阅文献［7］、匹配数据库，推测该化合物为靛苷，属于生物碱类成分。

峰19 准分子离子峰m/z729.261 0 ［M ＋COOH］-，保留时间6.26 min，分子式C32H44O16；二级质谱图中主要是糖苷键断裂，先丢失一分子或两分子葡萄糖，再丢失CH2O 形成的碎片离子m/z521.202 5 ［M-H-Glc］-、359.152 3 ［M-H-2Glc］-、329.142 4 ［M-H-2Glc-CH2O］-，通过比对对照品、查阅文献［12］、匹配数据库，推测该化合物为落叶松树脂醇B，属于苯丙素类成分。

峰20 准分子离子峰m/z181.014 5 ［M-H］-，保留时间6.65 min，分子式C8H6O5； 二级质谱图中主要是连续脱去中性分子CO2后形成的碎片离子m/z137.022 4 ［M-H-CO2］-、m/z93.034 4 ［MH-2CO2］-，通过查阅文献［7］、匹配数据库，推测该化合物为2-羟基-1，4-苯二甲酸，为有机酸成分。

峰24 准分子离子峰m/z431.097 9 ［M-H］-，保留时间7.75 min，分子式C21H20O10； 二级质谱图碎片离子主要有m/z341.068 9 ［M-HC3H6O3］-、311.056 5 ［M-H-C4H8O4］-、283.060 0［M-H-C5H10O5］-，通过比对对照品、查阅文献［13］、匹配数据库，推测该化合物为牡荆苷，属于黄酮类成分。

3.2 整体质量评价 选择3 个主要生产企业Q1、Q5、Q9 （收集批次最多） 的33 批样品（Q1 13批，Q5 11 批，Q9 9 批） 作为研究对象，采用SPSS 19.0 软件，以平均Euclidean 距离为度量标准，通过组间连接法，以37 个共有峰峰面积为变量进行系统聚类分析，结果见图2。由此可知，组间距为10 时各批样品聚为3 类，Q1 的3、19、2、43、33、1、18、30、32、5、53，Q5 的31、71、34、37、41、8、105、29 为一类； Q1 的10、61，Q5 的17、107，Q9 的44、106、20、27、35、26、72、21、13 为一类； Q5 的49 为一类，表明其总体聚类区分较明显，同一生产企业样品质量一致性较好，而不同生产企业的较差。

图2 33 批复方板蓝根颗粒聚类分析图Fig.2 Cluster analysis plot for thirty-three batches of samples

采用SIMCA-P 13.0 软件，以37 个共有峰峰面积为自变量，各批样品为应变量，采用偏最小二乘法-判别分析 （PLS-DA） 依次提取3 个主成分，模型解释率R2X为0.653，预测能力参数Q2为0.784，均高于0.5，说明拟合程度较好。将模型建立时分类Y矩阵变量定义为随机排列20 次，并进行置换检验，得到R2为0.279，Q2为-0.322，表明模型未出现过拟合。经PLS-DA 模型拟合分析得到散点图、置换检验图、VIP 图，分别见图3 ～5，可知不同生产企业样品分别聚类，区分较明显，与聚类分析结果一致，表明其质量存在一定差异，但同一生产企业不同批次样品质量差异较小。再对模型各投影VIP 参数进行分析，其数值大于1 表明有显著影响，可作为质量差异标志物，其中尿苷、鸟苷、腺苷、柠檬酸、酪氨酸是对分类起到最重要作用的5 个变量，即为区分不同生产企业样品的重要指标，提示在生产过程中应重点监控其质量变化以减少批次间差异，保证整体质量稳定。

图3 PLS-DA 得分散点图（3 家生产企业）Fig.3 Score scatter plot for PLS-DA （ three production enterprises）

图4 模型置换检验图Fig.4 Permutation test plot for model

图5 PLS-DA VIP 值Fig.5 VIP values for PLS-DA

采用SIMCA-P 13.0 软件，以37 个共有峰峰面积为自变量，112 批样品为应变量进行PLS-DA 分析，结果见图6。由此可知，Q30 样品65、66 与Q19 样品42 明显离群，与其他生产企业样品差异较大，并且 （R，S） -告依春、腺苷、鸟苷、尿苷、靛玉红色谱峰峰面积明显小于其他样品，提示其投料的板蓝根、大青叶质量较差。

图6 PLS-DA 得分散点图（所有生产企业）Fig.6 Score scatter plot for PLS-DA （ all production enterprises）

尿苷、鸟苷、腺苷为板蓝根、大青叶共有核苷类成分，是区分不同生产企业样品的重要指标，而（R，S） -告依春为2020 年版《中国药典》 规定的板蓝根指标成分。为了更好地评价复方板蓝根颗粒质量，本实验采用HPLC 法测定上述4 种成分的含量，结果见表2。由此可知，不同生产企业样品中各成分含量存在显著差异； 3 家生产企业样品中其平均含量依次为Q5＞Q1＞Q9，并且Q9 样品中各成分总含量仅为Q5 的21.4%，表明其质量不佳；Q19、Q30 的3 批样品中各成分含量偏低，与PLSDA 分析结果一致，可能存在药材质量较差或不足量投料生产的情况。

4 讨论

复方板蓝根颗粒具有较强的抗菌、抗病毒、增强免疫力等功效［16］，但其现行标准质量控制项目不足，缺乏专属性，是导致企业间产品质量参差不齐的重要原因。另外，水提醇沉工艺不利于靛玉红溶出； 部分企业所用板蓝根、大青叶质量较差，使得指标成分［如靛玉红、（R，S） -告依春等］ 含量较低； 可能存在不足量投料生产的情况。

本实验采用UPLC-Q-TOF-MS 法对复方板蓝根颗粒物质基础进行研究，参考文献、数据库匹配、二级质谱分析，共鉴定出37 个化合物，主要为生物碱、苯丙素、核苷、有机酸、黄酮等，其中板蓝根中的生物碱类成分具有多种药理活性，如抗病毒、抗炎、抗菌、抗肿瘤等［17-19］，有机酸、核苷类成分具有显著的抗内毒素活性［20-21］，结合氨基酸具有抗病毒、抗炎等作用［22］。再通过聚类分析、PLS-DA 等化学计量学方法评价了复方板蓝根颗粒整体质量，可为该制剂后续相关研究提供科学依据和数据支撑。