荆银颗粒HPLC 指纹图谱建立及13 种成分测定

2023-10-30张艳欣江美芳王丹丹

中成药 2023年10期

张艳欣，江美芳，2＃，王丹丹*

（1.上海上药杏灵科技药业股份有限公司，上海 200120； 2.上海中医药大学，上海 200120）

荆银颗粒由荆芥、金银花、四季青、鱼腥草、大青叶、蒲公英、牛蒡子、防风、甘草9 味药材组成，具有疏风清热、宣肺利咽的作用，临床用于治疗风热感冒［1］。方中荆芥辛温疏解，温而不燥，入肺肝二经，为治风温之主药［2］，而金银花清热解毒，宣散透表，为清热解毒之要药［3］；臣药四季青、蒲公英、大青叶均可清肺热，增强君药清热解毒之功［4］；佐药鱼腥草、牛蒡子具有宣肺化痰、解毒利咽之功［5-6］；使药甘草、防风功效解毒和中、调和诸药［7］。以往研究证实，荆银颗粒具有抗炎、抗病毒作用［8-13］，被推荐用于H1N1 甲型流感病毒、COVID-19 新型冠状病毒的预防与治疗［14-17］。然而，荆银颗粒现行质量标准仅有TLC鉴别、原儿茶醛含量测定［18-19］，难以全面评价该制剂整体质量。

指纹图谱［20-23］具有中药多组分、多靶点的整体作用特点，是从全成分角度出发的一种现代中药质量控制方法，比单一成分更全面。本实验建立荆银颗粒HPLC 指纹图谱，并测定原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、升麻素苷、甘草苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、5-O-甲基维斯阿米醇苷、异绿原酸C、牛蒡子苷的含量，以期为该制剂质量标准提升提供依据。

1 材料

Waters Acquity ARC 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； KQ5200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； Direct-Q 3UV 型超纯水机（美国Millipore 公司）。

原儿茶酸（批号5668，纯度100%）、咖啡酸（批号7403，纯度99.7%）、隐绿原酸（批号3208，纯度98.0%）、升麻素苷（批号3246，纯度99.6%）、甘草苷（批号9722，纯度100.0%）、芦丁（批号5981，纯度91.7%）、木犀草苷（批号6567，纯度99.3%）、异绿原酸B （批号3089，纯度98.5%）、异绿原酸A （批号10639，纯度99.0%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号6381，纯度99.6%）、牛蒡子苷（批号5691、纯度98.3%）对照品均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；绿原酸对照品（批号A22GB158496，纯度99.4%）购自上海源叶生物科技有限公司；异绿原酸C 对照品（批号22070639，纯度98.0%）购自上海泰坦科技股份有限公司。

荆银颗粒共23 批（批号211201、220401、220402、220403、220404、220405、220406、220407、220408、220409、220410、220411、220412、220413、220414、220501、220502、220503、220504、220701、220704、220708、221203，编号S1 ～S23），由上海上药杏灵科技药业股份有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters CORTECS C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流动相0.1%磷酸（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0 ～3 min，95% A； 3 ～16 min，95% ～90% A； 16 ～21 min，90% ～88% A；21～35 min，88% ～83%A； 35 ～55 min，83% ～70%A；55 ～65 min，70% ～55% A； 65 ～66 min，55% ～5%A）；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长210 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液取原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、升麻素苷、甘草苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、5-O-甲基维斯阿米醇苷、异绿原酸C、牛蒡子苷对照品适量，置于5 mL量瓶中，50% 甲醇溶解稀释，即得（各成分质量浓度分别为0.458、0.548、0.438、0.678、0.386、0.234、0.321、0.309、0.356、0.436、0.386、0.504、0.245 mg/mL），密闭保存。

2.2.2 供试品溶液精密称取23 批样品，每批2.5 g，加入50% 甲醇25 mL，称定质量，超声（200 W、40 kHz）处理30 min，70%甲醇补足减失的质量，12 000 r/min 离心10 min，取上清液，即得。

2.2.3 单味饮片溶液根据处方工艺，取荆芥、金银花、四季青、鱼腥草、大青叶、蒲公英、牛蒡子、防风、甘草单味饮片适量，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

纯氮施用量为102 kg/hm2。基肥可施用复合肥（10∶8∶24）594 kg/hm2，采用定点定位环行施肥法在理墒前施下。提苗肥在烟株移栽后7 d内施加，30%的追肥在栽后20～25 d施加。

2.3 HPLC 指纹图谱建立

2.3.1 精密度试验取本品适量，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得各共有峰峰面积RSD 均小于2.53%，相对出峰时间RSD 均小于0.46%，表明该方法精密度良好。

2.3.2 重复性试验取本品6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各共有峰峰面积RSD 均小于3.00%，相对出峰时间RSD 均小于0.38%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验取供试品溶液适量，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各共有峰峰面积RSD 均小于2.91%，相对出峰时间RSD 均小于0.16%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.4 图谱生成取23 批样品，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版） ” 建立指纹图谱，设定时间窗宽度为0.1 min，进行多点校正和Mark 峰匹配，再通过中位数法建立对照指纹图谱（R），见图1。由此可知，共有16 个共有峰，其相对保留时间RSD 为0.03% ～0.43%，表明各批样品出峰时间稳定，同时由于绿原酸（峰4）峰面积较大，保留时间适中，分离度较好，故选择其作为参照峰（S）。另外，各批样品色谱图与对照指纹图谱的相似度均超过0.970，可用于其整体质量控制。

图1 23 批荆银颗粒HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints for twenty-three batches of Jingyin Granules

图2 对照品HPLC 色谱图（A）、对照指纹图谱（B）Fig.2 HPLC chromatogram of reference substances （A）and reference fingerprint （B）

图3 荆银颗粒、单味饮片HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of Jingyin Granules and single decoction pieces

2.4 各成分含量测定

2.4.1 专属性试验取本品适量，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，发现各成分色谱峰均具有良好的分离度、峰形对称性，并且与相应对照品一一匹配，表明该方法专属性良好。

2.4.2 线性关系考察取各对照品适量，按“2.2.1” 项下方法制备不同质量浓度的相应溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Results of content determination of various constituents

2.4.3 精密度试验取本品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、升麻素苷、甘草苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、5-O-甲基维斯阿米醇苷、异绿原酸C、牛蒡子苷峰面积RSD 分别为0.17%、0.48%、0.64%、0.09%、0.73%、0.26%、2.10%、2.53%、1.18%、2.44%、0.76%、0.82%、2.26%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验取本品6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、升麻素苷、甘草苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、5-O-甲基维斯阿米醇苷、异绿原酸C、牛蒡子苷峰面积RSD 分别为0.20%、0.24%、0.81%、0.54%、0.25%、1.23%、2.60%、1.45%、2.09%、0.97%、0.56%、2.42%、0.39%，表明本方法具有良好的重复性。

2.4.5 稳定性试验取同一份供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、升麻素苷、甘草苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、5-O-甲基维斯阿米醇苷、异绿原酸C、牛蒡子苷峰面积RSD 分别为0.07%、0.70%、0.58%、0.15%、0.89%、1.42%、2.73%、0.78%、2.58%、1.23%、2.87%、0.71%、1.41%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验取各成分含量已知的本品9 份，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1” 项下方法制备与供试品溶液中各成分含量相同的对照品溶液，分别按后者的0.5、1.0、1.5 倍加到供试品溶液中，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、升麻素苷、甘草苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、5-O-甲基维斯阿米醇苷、异绿原酸C、牛蒡子苷平均加样回收率分别为99.87%、100.98%、97.26%、96.34%、98.13%、101.55%、98.77%、96.05%、101.96%、100.84%、97.29%、102.06%、99.91%，RSD 分别为1.97%、0.98%、1.37%、1.99%、2.16%、1.09%、1.97%、2.06%、1.74%、1.45%、2.76%、1.21%、1.04%。

2.4.7 样品含量测定取23 批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。