HPLC法测定补肾益脑片中补骨脂素和异补骨脂素的含量

内蒙古自治区天奇中蒙制药股份有限公司，内蒙古 赤峰 024000

HPLC法测定补肾益脑片中补骨脂素和异补骨脂素的含量

王亚辉李洪泽韩风雨

内蒙古自治区天奇中蒙制药股份有限公司，内蒙古 赤峰 024000

目的建立补肾益脑片含量测定方法。方法用HPLC法以Dikma C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：甲醇-水(45∶55)；检测波长：245nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min测定补肾益脑片中补肾脂数和异补肾脂数的含量。结果补骨脂素的含量在0.0744～0.4644μg范围内线性关系良好(r=0.9997)，异补骨脂素的含量在0.075～0.450μg范围内线性关系良好(r=0.9999)。补骨脂素平均回收率为99.668%，RSD%=0.94%；异补骨脂素平均回收率为99.5%，RSD%=1.85%。结论该含量测定方法简便、准确。

补肾益脑片；高效液相色谱法；补骨脂素、异补骨脂素；含量测定

补肾益脑片方由鹿茸(去毛)、红参、补骨脂(盐制)等十六味药组成。其功能主治为补肾益气，养血生精。用于气血两虚，肾虚精亏，心悸气短，失眠健忘，遗精盗汗，腰腿酸软，耳鸣耳聋。依据《中国药典》(2010版)中补肾益脑片标准[1]，经多次试验，确立了本品中补骨脂有效成分补骨脂素、异补骨脂素的含量测定方法，阴性无干扰，经方法学考察，方法的重现性、稳定性、精密度、回收率试验均符合有关规定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Lab Alliance高效液相色谱仪，Model 500检测器，Series III泵，ANASTAR色谱工作站，Dikma C18柱(4.6×250mm，5μm)；AB135-S电子分析天平；Model C3860A 超声波仪(上海超声仪器厂)。

1.2 试药 补骨脂素对照品(批号：110739-201115，中国食品药品检定研究院)；异补骨脂素(批号：110738-201012，中国食品药品检定研究院)；补肾益脑片(自制，批号20130217、20131007、20131008、20131009)。甲醇为色谱纯；水为二次蒸馏水，其试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 波长选择 称取补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，加甲醇溶液配成每1ml含0.06mg的溶液，在200～500nm的波长范围内扫描，在245nm处有最大吸收。

2.2 色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：甲醇-水(45∶55)；检测波长：245nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min。在此条件下，补骨脂素、异补骨脂素与其他组分均达到基线分离，理论板数按补骨脂素计算大于3000。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 分别取补骨脂素异补骨脂素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含25μg的混合溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率280W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.3.3 阴性溶液的制备 取除补骨脂外其它药材按供试品制备方法制成阴性样品溶液。

2.4 阴性干扰试验 精密吸取上述三种溶液各10μl，注入液相色谱仪中，绘制液相色谱图，在对照品色谱相应的位置，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，阴性液在此峰位无吸收，表明该方法专属性良好。

2.5 线性范围考察 分别精密吸取补骨脂素对照品溶液7.74、15.48、23.22、30.96、38.7、46.44μg/ml；异补骨脂素对照品溶液7.5、15、22.5、30.0、37.5、45.0μg/ml，按拟定的色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，补骨脂素、异补骨脂素进样量(μg)坐标绘制标准曲线，计算得回归方程。补骨脂素为：Y=5020682X-387.807(r=0.99974)；异补骨脂素为Y=5079826X-18635.9(r=0.9999)。补骨脂素、异补骨脂素分别在0.0744-0.4644μg和0.075-0.450μg范围内与峰面积程良好的线性关系。

2.6 稳定性性试验 取样品(批号20130217)，研细，取粉末3.0g，精密称定，按正文“2.3”制备供试液，精密吸取同一供试液，分别于0、2、4、6、8、10h进样分析，测定色谱峰面积，RSD%为0.97%，故供试液10h内具有良好的稳定性。

2.7 精密度试验 精密吸取同一浓度供品溶液10μl，连续进样5次，测定峰面积，补骨脂素与异补骨脂素RSD%分别为1.43%和1.34%。

2.8 重复性试验 取本品(批号20130217)，研细，分别取五份，精密称定，分别按正文“2.3”方法操作，测定，补骨脂素含量为4.9999、0.5042、0.5038、0.5005、0.4882 mg/g，异补骨脂素含量为0.4526、0.4729、0.4620、0.4584、0.4558 mg/g，总含量RSD%为1.31%，表明本试验重复性良好。

2.9 回收率考察 精密称取本品(批号20130217，补骨脂素含量0.4993mg/g和异补骨脂素含量0.4603mg/g)五份，每份分别加补骨脂素对照品(0.1162mg/ml)5ml和异补骨脂素(0.1072mg/ml)5ml，按正文“2.3”制备供试品溶液，按上述色谱条件依法测定，结果如下：

表1 补骨脂素回收率试验测定结果

测定结果提示：本方法补骨脂素回收率在98.12%～100.27%之间，RSD为0.94%，符合有关规定。

表2 异补骨脂素回收率测定结果

测定结果提示：本方法异补骨脂素回收率在 97.82%～102.52%之间，RSD为1.86%，符合有关规定。

2.10 样品含量测定 按照以上方法条件，测定三批样品中补骨脂素和异补骨脂素的含量，结果如下。

表3 三批样品含量测定结果

根据《中国药典》2010年版一部补骨脂项下补骨脂素和异补骨脂素的含量规定：按干燥品计，本品含补骨脂素(C11H6O3)和异补骨脂素(C11H6O3)的总量不得少于0.70%。暂定本品每片含补骨脂素(C11H6O3)和异补骨脂素(C11H6O3)的总量计，不得少于0.23mg。

3 讨论

[2]，对索氏提取和超声提取，且对超声提取时间进行考察。结果表明超声提取在30min提取已完全且与索氏提取含量相当，由于超声提取方便，故选择超声提取30min。

测定结果表明，选用补骨脂素和异补骨脂素作为定量检测指标以及建立的HPLC色谱条件，方法灵敏度高，专属性强，重现性好并通过对三批样品含量及药材含量进行考察，可作为补肾益脑片质量控制指标之一。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2]张卫红,郑玉光,李晓松,等.HPLC法测不同产地补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的含量[J].河北中医药学报,2008,23(1)：43.

R284.1

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1007-8517(2014)17-0019-02

2014.07.09)