常绿钩吻碱微乳处方优化及其安全性评价

蒋文文，宋 煜*，许 文，2，郭芷怡，吴水生，3*

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122； 2.福建中医药大学生物医药研发中心，福建 福州 350122； 3.福建省中药产业技术开发基地，福建 福州 350122）

常绿钩吻碱是从钩吻中提取分离得到的一种育亨宾型生物碱，因其抗肿瘤活性而引起广泛关注。近年来研究表明，常绿钩吻碱在治疗神经胶质瘤方面具有很好的效果［1］，但该成分存在水溶性差［2］、血脑屏障的问题，会影响其发挥药效。

前期报道，鼻腔给药后药物分子可通过嗅区沿着包绕在嗅球神经束周围的连接组织或嗅神经元的轴突到达脑脊液或脑室，从而绕过血脑屏障进入脑部而发挥药效［3］。微乳是由油相、乳化剂、助乳化剂、水相按照一定比例自发形成的粒径在100 nm 以下的热力学稳定分散体系［3］，能增加难溶性药物溶解度［4］及其黏膜渗透性［5］。本实验选择微乳作为载体，将常绿钩吻碱制成鼻用制剂，并优化其处方，再进行质量评价，以期为后续相关开发提供基础。

1 材料

1.1 仪器 ME204E 电子天平［万分之一，梅特勒-托利多仪器 （上海） 有限公司］； NICOMP 380ZLS 纳米粒度及电位分析仪（美国PSS 粒度仪公司）； Waters ACQUITY UPLC System 超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； H2050R 高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）； ZLCL-2A磁力搅拌器（巩义市英峪博研仪器设备厂）。

1.2 试剂与药物 常绿钩吻碱对照品（武汉天植生物技术有限公司，批号CFS201902）； 常绿钩吻碱原料药（实验室自制）。吐温-80 （Tween-80，批号C11408815）、聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH40，批号C12462376）、Labrasol （批号C11372212）、1，2-丙二醇 （批号C11905857）、蓖麻油 （批号C10798619）、中碳链三甘油酯（批号Y13A10C95047 ）、油酸乙酯（EO，批 号C10889647） （上海麦克林生化科技有限公司）； 聚氧乙35 蓖麻油（EL-35，上海源叶生物科技有限公司，批号H27D10A106957）； Solutol HS 35 （美国MedChemExpress 公司，批号62908）； 1，3-丁二醇（上海易恩化学技术有限公司，批号R005156）； 无水乙醇 （国药集团化学试剂有限公司，批号20190910）； 聚乙二醇400 （PEG400，北京索莱宝科技有限公司，批号722Y014）； Labrafil M 1944 CS （嘉法狮上海贸易有限公司，批号3063BA2）。

1.3 动物 普通级中华大蟾蜍，雌雄兼具，体质量40～50 g，购于市场。SPF 级雄性SD 大鼠，体质量180～200 g，购于杭州医学院，动物生产许可证号 SCXK （浙） 2019-02，合格证编号20211229Aazz0100000407。

2 方法与结果

2.1 常绿钩吻碱含量测定

2.1.1 色谱条件 ACQUITY UPLC ® BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）； 流动相0.1%甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0～0.5 min，10%B； 0.5 ～2.0 min，10% ～80% B； 2.0 ～2.5 min，80% B； 2.5 ～2.8 min，80% ～10% B； 2.8 ～5.0 min，10% B）； 体积流量0.25 mL/min； 柱温45 ℃； 检测波长242 nm； 进样量2 μL。

2.1.2 线性关系考察 取常绿钩吻碱对照品适量，甲醇制成系列质量浓度，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝30 048X-62 693 （r＝0.999 9），在2.5 ～30 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3 方法学考察 日内、日间精密度RSD 均小于2%； 高、中、低质量浓度平均加样回收率分别为99.47%，99.76%、100.37%，RSD 分别为0.85%、1.02%、1.44%，均符合相关要求。

2.2 乳化剂、助乳化剂筛选 采用溶解度法，取过量常绿钩吻碱粉末，分别与Tween-80、RH40、EL-35、Labrasol、Solutol HS 35、1，2-丙二醇、1，3-丁二醇、无水乙醇、PEG 400、丙三醇、Transcutol P 各1.0 g 混合，超声处理30 min，置于振荡器中振荡48 h，15 000 r/min 离心10 min，取上清，甲醇适当稀释，按“2.1.1” 项下方法测定溶解度，重复3 次，取平均值［6］，结果见表1。由此可知，常绿钩吻碱在Tween-80 中的溶解度最大，其次是在RH40 中，并且在助乳化剂1，2-丙二醇中的溶解度最大，考虑材料安全性、药物溶解度，确定乳化剂为Tween-80、RH40，助乳化剂为1，2-丙二醇。

表1 常绿钩吻碱溶解度测定结果（n＝3）Tab.1 Results of solubility determination of sempervirine（n＝3）

2.3 处方筛选 表1 显示，常绿钩吻碱在各油相中的溶解度均较低，并且仅在Labrafil M 1944 CS、蓖麻油、中碳链三甘油酯、油酸乙酯中能检测到，故在进行油相筛选时主要以油相与混合乳化剂（乳化剂与助乳化剂混合） 所形成的微乳区域面积来决定其种类。查阅文献［7-12］ 发现，微乳处方质量比Km值大多为2，故采用伪三元相图确定油相［13-14］。

将1，2-丙二醇分别与2 种乳化剂（Tween-80、RH40） 按Km2 ∶1 制成混合乳化剂，再分别与Labrafil M 1944 CS、蓖麻油、中碳链三甘油酯、油酸乙酯按Km1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3、8 ∶2、9 ∶1 在恒温磁力搅拌器上混合均匀，向混合物中滴加水，通过目测法判断由澄清变浑浊或由浑浊变澄清的滴定终点，记录微乳形成时各组分量，采用Origin 2018 归一化处理绘制伪三元相图，结果见图1 ～2。由此可知，以Labrafil M 1944 CS 为油相，RH40 为乳化剂，1，2-丙二醇为助乳化剂时微乳区域面积最大，故选择其作为处方。

图1 空白微乳伪三元相图（乳化剂RH40）Fig.1 Pseudo ternary phase diagrams of blank microemulsions （emulsifier was RH40）

图2 空白微乳伪三元相图（乳化剂吐温-80）Fig.2 Pseudo ternary phase diagrams of blank microemulsions （emulsifier was Tween-80）

2.4 处方优化 采用Box-Behnken 响应面法［15-17］。

根据图1 ～2，确定油相用量为5% ～10%，乳化剂用量为15% ～30%，助乳化剂用量为10% ～20%。以油相（A）、乳化剂（B）、助乳化剂（C）用量为影响因素，粒径（Y1）、载药量（以常绿钩吻碱含量计，Y2） 为评价指标，结果见表2。

表2 试验设计与结果（n＝3）Tab.2 Design and results of tests （n＝3）

按照表2 方案称取相应用量的乳化剂、助乳化剂，混合后加入相应用量的油相，加水补足剩余量，再加入过量常绿钩吻碱，恒温（37 ℃） 振荡48 h，取出，15 000 r/min 离心10 min，上清液用甲醇适当稀释，测定常绿钩吻碱载药量，再将微乳加水稀释1 倍，采用激光粒度仪测定粒径，Design-Expert 8.0.6 软件进行方差分析，结果见表3 ～4、响应面分析见图3～4。

图3 各因素响应面图（粒径）Fig.3 Response surface plots for various factors （particle size）

图4 各因素响应面图（载药量）Fig.4 Response surface plots for various factors （drug loading）

表3 粒径方差分析Tab.3 Analysis of variance for particle size

表4 载药量方差分析Tab.4 Analysis of variance for drug loading

由于微乳粒径越小，越有利于药物吸收； 载药量越高，临床用量越小，故以平均粒径最小值、载药量最大值为指标，得到最优处方为油相（Labrafil M 1944 CS）、乳化剂（RH40）、助乳化剂（1，2-丙二醇）、水用量5%、19.53%、19.25%、56.22%，粒径为 32.21 nm，载药量为 2.205 mg/mL。再对数据进行拟合，得到方程分别为Y1＝-354.273 61＋59.160 00A＋ 25.992 87B＋4.427 50C-4.489 33AB-0.145 33BC-0.468 47B2＋0.088 889AB2、Y2＝- 2.002 62 - 0.104 05A＋0.426 88B- 0.048 962C＋8.813 33 × 10-3AB-9.080 00×10-3AC-5.153 33×10-3BC-9.898 71×10-3B2＋8.257 89 × 10-3C2（r1＝0.963 6，r2＝0.969 6），可知模型P值均小于0.01； 粒径、载药量失拟项P值分别为0.054 7、0.081 3，均大于0.05，表明模型拟合理想，可用于预测分析。

按上述优化处方制备3 批样品，测定其粒径、载药量，结果见表5。由此可知，模型预测性良好，可用于处方优化，并且其载药量比在水溶液中提高了7.08 倍。

表5 验证试验结果（n＝3）Tab.5 Results of verification tests （n＝3）

2.5 微乳制备及质量评价

2.5.1 制备工艺 按“2.4” 项下优化处方精密称取各辅料适量，先将RH40 与1，2-丙二醇混匀，再加入油相混匀，得到非水相，边搅拌边缓慢加入处方量蒸馏水，即得空白微乳； 加入常绿钩吻碱后搅拌混匀，再加入处方量水相混匀，即得载药微乳。

2.5.2 评价指标

2.5.2.1 外观 按“2.4” 项下优化处方制备空白微乳、载药微乳各3 批，发现后者为黄绿色透明溶液，底部未见分层或沉淀。

2.5.2.2 粒径 取“2.5.1” 项下微乳适量，采用粒径仪测得空白微乳、载药微乳粒径分别为28.7、32.6 nm，粒径分布系数分别为0.123、0.165，见图5。

图5 各样品粒径分布Fig.5 Particle size distribution of various samples

2.5.2.3 形态 以少量2%磷钨酸负染载药微乳后滴加到200 目铜网上，自然挥干，在透射电镜下观察其形态［4］，结果见图6，可知该制剂呈球形或类球形。

图6 常绿钩吻碱微乳透射电镜图Fig.6 Transmission electron microscopy image of sempervirine microemulsions

2.6 鼻纤毛毒性研究

2.6.1 纤毛毒性实验 25 只蟾蜍随机分为5 组，每组5 只，探针破坏脊髓、脑部，向上颚黏膜滴加0.5 mL 生理盐水，当黏膜完全被溶液覆盖时充分接触20 min，手术剪小心剥离上颚黏膜（面积约3 mm×3 mm），立即用生理盐水洗净血丝与杂物，纤毛面向上平铺于载玻片上，滴加少量生理盐水后从一侧缓慢盖上盖玻片，在生物显微镜（放大400倍） 下观察纤毛摆动情况，再立即将载玻片置于含有少量蒸馏水的层析缸中，在25 ℃下密闭保存，每隔25 min 取样观察，在盖玻片边缘先滴加适量生理盐水，观察纤毛摆动情况，直至纤毛停止运动［18］。另取呋麻滴鼻液（含1%盐酸麻黄碱）、1%脱氧胆酸钠、空白微乳、载药微乳适量，同法处理，观察纤毛摆动情况。

2.6.2 指标检测

2.6.2.1 纤毛持续摆动时间 记录给药开始到纤毛停止摆动时间，即为纤毛持续摆动时间，再分别以生理盐水组、呋麻滴鼻液组为100%，计算其他各组纤毛摆动时间与其比例，即为相对运动占比，其数值越大，对鼻纤毛毒性越小［19］，结果见表6。

表6 纤毛持续摆动时间测定结果（n＝6）Tab.6 Results of cilium continuous swing time determination （n＝6）

2.6.2.2 纤毛形态 在生物显微镜下观察各组蟾蜍上颚纤毛形态，结果见图7。由此可知，1% 脱氧胆酸钠组蟾蜍纤毛基本脱落，即对其运动有显著抑制作用； 生理盐水组、呋麻滴鼻液组、常绿钩吻碱微乳组蟾蜍纤毛排列整齐，摆动状态活跃，表明常绿钩吻碱、辅料、微乳对鼻纤毛运动的影响较小，毒性较低，应用鼻腔给药安全性较高。

图7 各组蟾蜍上颚纤毛形态Fig.7 Ciliary morphologies of Bufo bufo gargarizans Cantor upper jaw in various groups

2.7 鼻黏膜刺激性实验 30 只大鼠随机分为5组，分别为生理盐水组、呋麻滴鼻液组、1%脱氧胆酸钠溶液组、空白微乳组、常绿钩吻碱微乳组，平头微量注射器进行鼻腔给药，剂量为单侧50 μL，给药后从外侧轻压鼻翼以防止药液流失，每天1 次，连续7 d，第7 天给药后24 h 处死大鼠，取鼻中隔黏膜，固定于4%多聚甲醛中，进行石蜡包埋切片、HE 染色，在显微镜下观察其形态［18］，结果见图8。由此可知，生理盐水组、呋麻滴鼻液组、空白微乳组、常绿钩吻碱微乳组大鼠鼻黏膜完整，结构清晰，黏膜上纤毛整齐，表明对鼻黏膜无刺激性； 1%脱氧胆酸钠溶液组大鼠黏膜纤毛脱落，结构不完整，表明具有明显的鼻黏膜刺激性。

图8 各组大鼠鼻黏膜纤毛形态Fig.8 Ciliary morphologies of rat nasal mucosa in various groups

3 讨论与结论

常绿钩吻碱在水中的溶解度很小，而鼻腔内药液容纳量有限［20］，限制了其每次用药量。本实验将该成分制成微乳以提高其载药量，需重视辅料载药能力，故先采用水滴定法绘制伪三元相图，再以星点效应-响应面法优化处方。根据相关研究及2020 年版《中国药典》，可知本实验所得最优处方中的药用辅料用量在安全合理范围内，可应用于鼻腔。

前期预实验发现，油相对药物的溶解度很小，虽然其占比低于5%时微乳粒径变化不大，但在一定程度上有利于药物与脑部毛细血管内皮细胞的亲和性［21］，故其取值范围仅占5% ～10%。考虑到微乳黏度过大时不利于临床应用、药物分散，故水相比例不宜少于40%，同时乳化剂与助乳化剂比例过大时会有潜在毒性，故结合三元相图设定乳化剂用量范围为15% ～30%，助乳化剂用量范围为10% ～20%。

本实验采用鼻腔给药方式进行安全性评价，目的是通过鼻—脑通路使药物靶向脑部，故鼻腔纤毛毒性是重要研究内容。首先，采用在体蟾蜍上颚模型来考察空白制剂、常绿钩吻碱微乳对鼻纤毛的影响。再观察给药后大鼠鼻黏膜组织结构、表面纤毛形态变化，发现该制剂鼻黏膜毒性较小，可应用于鼻腔。

综上所述，本实验将常绿钩吻碱制成微乳以解决该成分溶解度差的问题，并考察其鼻腔给药安全性，可为临床治疗脑胶质瘤提供依据。