烟草种子直接诱导愈伤组织的方法探究

彭 也,许健成,余璐璐,何正权,徐 飞

(1.三峡大学 生物与制药学院,宜昌 443002;2.武汉生物工程学院 应用生物技术研究中心,武汉 430415)

烟草(NicotianatabacumL.)为茄科烟草属一年生草本植物,在我国南北方均有种植,主要用作工业原料,以及用于药用麻醉、催汗和镇痛等方面,应用范围广且具有较高的经济价值[1]。烟草也是一种重要的模式植物,是研究细胞脱分化和再分化的理想材料,也是植物遗传转化和基因功能鉴定分析的重要载体[2]。

愈伤组织培养是获得再生植株和遗传转化的基础,已被广泛应用于农业、园林等各项生产中,在细胞生物学、分子生物学和基因工程等研究领域也发挥着重要作用,因此,如何获得优良的愈伤组织对农业生产以及科学研究尤为重要。通过叶片外植体诱导烟草愈伤组织较为常见[3]。根和茎等组织也是适合诱导愈伤组织的材料[4]。采用叶片等作为外植体诱导愈伤,虽然技术成熟,但此类外植体来源耗时长,消毒过程中容易对外植体造成损伤,且操作过程污染率较高。若能以种子直接诱导愈伤,不仅能缩短获得外植体的时间,且种皮能保护种子从而减少在消毒过程中的损伤,提高出愈率。然而较之小麦、玉米和水稻等作物,烟草利用种子诱导愈伤组织的技术体系鲜有报道。

愈伤组织的诱导除了受外植体的影响,还与培养基的类型和外源激素成分、比例等因素有关[5]。在培养植物愈伤组织的过程中,激素发挥着重要的作用。以往研究中,愈伤组织诱导多以MS为基础培养基,再施加5种常用植物激素作为诱导剂,包括生长素类(auxins)的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophe noxyacetic acid,2,4-D)、萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid,NAA)和3-吲哚丁酸(indole-3-butyric acid,IBA),以及细胞分裂素类(cytokinins)的6-苄氨基嘌呤(6-benzylami nopurine,6-BA)和激动素(kinetin,KT)[6-9]。不同外植体诱导愈伤的最佳激素配比不尽相同[8-9]。换言之,在培养基中引入不同比例的生长素和细胞分裂素,会影响诱导愈伤组织的成功率。

本研究以烟草种子为研究对象,探究不同浓度的2,4-D和6-BA激素配比对烟草愈伤组织形成的影响,并对诱导出的愈伤组织进行形态学和组织细胞学的比较观察,旨在为利用烟草种子直接诱导愈伤组织提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的烟草种子为普通烟草(NicotianatabacumL.cv NC89)。新鲜收取或储藏期不超过3个月的种子用于研究。

1.2 方法

1.2.1 诱导培养基

以MS+3%蔗糖+0.8%琼脂固体培养基作为基础培养基,添加不同浓度2,4-D和6-BA两种激素,用NaOH将培养基pH值调整到5.8～6.0。将配好的培养基高压灭菌(0.15 MPa、121 ℃条件下灭菌20 min)后备用。

本实验在前期研究中发现,高浓度(>2.0 mg/L)的2,4-D和6-BA不利于种子诱导出愈伤组织,为进一步明确两者对种子诱导愈伤的最佳条件,本研究在前期实验的基础上,设计了6个水平的2,4-D和6个水平的6-BA,共12种组合进行比较与分析。具体激素浓度处理方案如表1所示。

表1 不同诱导培养基中的激素组合

1.2.2 芽分化培养基

以MS+3%蔗糖+0.8%琼脂固体培养基作为基本培养基,添加0.3 mg/L NAA+2.35 mg/L 6-BA,用NaOH将培养基pH值调整到5.8～6.0。将配好的培养基高压灭菌(0.15 MPa、121 ℃条件下灭菌20 min)后备用。

1.2.3 烟草种子的预处理

取适量烟草种子,用蒸馏水浸泡24 h后,用84消毒液消毒7～8 min,然后用无菌水清洗5次。将消毒后的烟草种子均匀接种在不同激素配比的愈伤组织诱导培养基上,转入16 h光照[60～100 μmol/(m2·s)]/8 h黑暗,(25±1) ℃条件下进行愈伤组织诱导培养。

1.2.4 烟草愈伤组织观察、统计与分析

实时记录烟草愈伤组织诱导情况,并在体式显微镜(SteREO Discovery.V20,卡尔蔡司管理有限公司)下观察愈伤组织生长状况,比较不同激素配比诱导烟草种子愈伤组织情况的差异。

统计不同培养基上烟草种子诱导形成愈伤组织的数量,并计算诱导率;诱导率=(产生愈伤组织的种子数/接种的种子数)×100%。本实验中,以愈伤组织直径≥1 mm定义为诱导出了愈伤组织。

1.2.5 烟草愈伤组织切片观察

取诱导出的烟草愈伤组织,经FAA固定后,依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、展片、脱蜡、番红固绿染色和封片操作后制成石蜡切片,并使用光学显微镜采集图像信息[10-11]。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对烟草种子出愈速率的影响

为探究不同激素配比对烟草种子愈伤组织诱导的影响,采用不同浓度的2,4-D和6-BA进行组合处理烟草种子。结果表明:不同激素配比均能诱导出烟草种子愈伤组织,但出愈速度及愈伤形态存在明显差异。种子在不含激素的培养基中正常生长,叶片和根系长势好(对照组材料);相比之下,在仅含有1.0 mg/L 2,4-D的培养基中,种子萌发后的幼苗整体呈水渍状,愈伤组织小且质量差(图1)。在仅含有1.0 mg/L 6-BA的培养基中,种子萌发后未快速进入愈伤组织生长状态,而是呈现出较为明显的根系发育,虽然其生长比对照组缓慢(图1)。值得注意的是,种子在1.0 mg/L 2,4-D+(0.5～2.0)mg/L 6-BA激素配比条件下未见根系的发育,而胚轴基部逐渐分化出愈伤组织(图1)。同样,种子在1.0 mg/L 6-BA+(0.5～2.0)mg/L 2,4-D激素配比培养条件下也能逐渐培养出愈伤组织(图1)。

空白对照(CK)及不同激素配比处理7 d(a)和14 d(b)愈伤组织生长状态,浓度(mg/L)。

统计愈伤组织出愈速率发现,虽然培养两周后2,4-D和6-BA组合均能诱导烟草种子长出愈伤,且出愈率为100%,但在不同2,4-D和6-BA浓度配比培养基上长出愈伤的速度和大小不同。烟草种子在1.0 mg/L 2,4-D的培养基中,搭配0.5～2.0 mg/L 6-BA可较快诱导出愈伤组织(表2);当用1.0 mg/L 2,4-D搭配0.1 mg/L 6-BA培养时,种子出愈速率较慢。相比之下,烟草种子在1.0 mg/L 6-BA的培养基中,搭配0.1～2.0 mg/L 2,4-D诱导愈伤组织能力较差,在培养的前7 d出愈率低于40%(表2);尽管如此,1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D在10 d以后出愈率明显提升,愈伤大小和质量也较好。

表2 不同激素组合对出愈率的影响

2.2 不同激素配比对愈伤组织生长的影响

进一步比较分析不同激素配比对诱导出的愈伤组织后期生长的影响,将获得的愈伤组织继续培养至21 d后,通过愈伤组织的致密性、颜色、直径和鲜重综合评估愈伤组织的质量。结果表明,在不同激素配比的诱导培养基中愈伤组织质量存在显著差异。在仅含有1.0 mg/L 2,4-D的培养基中,幼苗下胚轴及根部仍保持着明显的玻璃化现象,其膨大的下胚轴及根部呈透明水浸状,愈伤组织生长最慢,直径和鲜重在所有处理组中最小,最终无法呈现出良好的愈伤组织(图2,表3);在仅含有1.0 mg/L 6-BA的培养基中,幼苗发育有短且粗壮的根系,根部周围产生少量的白色松散状愈伤组织,诱导出的愈伤组织体积小,质量不佳(图2)。当培养基中含有1.0 mg/L 2,4-D搭配0.5～1.0 mg/L 6-BA时,诱导出的愈伤组织长势较好,这些愈伤组织的轮廓层次较清晰,呈淡绿色半透明堆块状,在体积和质量上与仅使用2,4-D激素诱导的愈伤相比都有明显优势(图2)。相比之下,1.0 mg/L 6-BA搭配0.5～2.0 mg/L 2,4-D处理条件下,愈伤组织块也进一步膨大,但较为松散,尤其是2,4-D浓度高于1.5 mg/L时(图2)。

空白对照(CK)及愈伤组织培养至21 d后的显微观察;随机取3株材料用体式显微镜观察并拍照;浓度(mg/L)。图中标尺长度为2 mm。

表3 不同激素组合诱导愈伤组织的比较分析

总体来看,当培养基中含1.0 mg/L 2,4-D时,随着6-BA的浓度减小愈伤组织的玻璃化程度会增加;当培养基中含有1.0 mg/L 6-BA,随着2,4-D浓度的增加愈伤组织越松散(图2,表3)。其中,1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA组合诱导出的愈伤组织淡绿色,堆块状,体积较大;0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA组合诱导出的愈伤组织淡绿色,较致密。综合分析,1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA这两种激素配比是诱导烟草愈伤组织的最佳组合。

2.3 胚性愈伤组织的诱导及不定芽的分化

为进一步分析获得的愈伤组织是否具有可诱导分化能力,移取培养30 d的愈伤组织到芽分化培养基中继续培养。结果表明,分化培养7 d后,取自0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA培养基中生长的愈伤组织开始分化出不定芽[图3(a)]。相比之下,取自1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA培养基中生长的愈伤组织未分化出芽,但愈伤组织的体积持续增大[图3(b)]。将这两种愈伤组织进行切片观察发现,前者具有分生细胞团结构,其细胞体积较小,排列规整紧密且边界明显,具有旺盛的细胞分裂能力,属于胚性细胞[图3(c)];后者细胞的排列不规则,细胞核较小,属于非胚性细胞[图3(d)和(e)]。结果表明,0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA的激素配比可用于诱导致密型胚性愈伤组织,适合用于再分化等实验。1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA的激素配比可用于诱导非胚性愈伤组织,这种愈伤组织可长期保持旺盛的生长。

3 讨论与结论

外植体的选择及愈伤诱导能力是影响烟草基因工程进展和种质资源创新的重要因素。虽然离体叶片作为外植体诱导烟草愈伤组织的技术已较为成熟,但仍存在诱导率低、前期准备周期长等局限性。以往的研究表明,外植体离合子胚阶段越远,就需要越多的细胞重编程过程形成胚性愈伤;合子胚中的细胞很容易发生体细胞胚胎发生,也具有较强的分裂能力,是诱导愈伤组织较合适的外植体材料[5,12-13]。考虑到成熟种子含有合子胚,本实验以成熟烟草种子作为外植体材料,探索并建立了直接利用种子诱导出愈伤组织的体系,尤其是能分化出胚性愈伤组织的诱导方法。

基于本研究,在MS基础培养基中加入一定浓度范围(0.1～2.0 mg/L)的2,4-D和6-BA可促进烟草种子向愈伤组织生长,但诱导出的愈伤组织大小和质量差异明显。相比之下,1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA的组合条件最适合烟草种子诱导松散的非胚性愈伤组织,0.1 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA的组合条件下最适合烟草种子诱导致密的胚性愈伤组织。本研究结果与利用烟草叶片等外植体在诱导愈伤组织时所适用的激素浓度存在明显差异。以往研究显示,烟草叶片诱导愈伤时采用的2,4-D激素浓度为1.0～2.0 mg/L[9,14];而关于6-BA的激素浓度选择,董行健等[15]采用0.20 mg/L 6-BA,而岳彩鹏等[16]采用0.5 mg/L 6-BA诱导烟草叶片愈伤组织。这些浓度对本研究中种子诱导愈伤也适用,但不是最佳的浓度比例,表明同一材料不同组织部位愈伤组织的诱导受激素比例的差异调控。

植物激素对体外植物组织培养有重要的影响,其中,生长素和细胞分裂素一直被认为是诱导外植体生成愈伤组织的关键激素,前者主要通过诱导体细胞获得干细胞特性形成愈伤组织,后者主要刺激愈伤组织再分化形成离体苗[17-19]。本实验采用的生长素和细胞分裂素分别是2,4-D和6-BA,两者均是组织培养中最常用的激素,对启动植物细胞脱分化过程十分重要[6,19]。本研究发现仅使用2,4-D或6-BA处理烟草种子时,诱导生成的愈伤组织呈水浸状透明色,无法发育成质量良好的愈伤块。当在培养基中同时添加2,4-D和6-BA后才能诱导出质量较好的愈伤组织,这表明两种激素在愈伤组织的诱导过程中存在协调作用[6,17,20]。尽管如此,不同外植体愈伤诱导的最佳激素配比不尽相同,这其中的生化、分子机理还有待进一步深入研究。