人干扰素ε的基因合成、原核表达及质谱表征

杨银河,狄 斌,杨大松

(1.大理大学 云南省昆虫生物医药研发重点实验室,大理 671000; 2.中国药科大学 药学院,南京 210009)

艾滋病(AIDS)是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染所导致的一种病死率极高的慢性传染病,艾滋病在全球范围内广泛传播,已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。据统计,中国共有艾滋病病毒感染者和艾滋病病人约85.0万例[1],目前尚无彻底治愈艾滋病的方法。

干扰素(IFN)是机体防御系统的重要组成部分,是一类具有调节机体免疫功能和抗病毒、抗肿瘤等广泛生物学活性的蛋白质。基于基因序列、染色体定位和受体特异性的不同将干扰素分为3种类型,I型干扰素包括α、β、ω、δ(猪)、κ、τ(羊和牛)、ε和ζ(Limitin,鼠) 8个亚型,具有显著的抗病毒功能,又称抗病毒干扰素。干扰素ε(IFN-ε)是2001年被发现的[2],其氨基酸序列和其他Ⅰ型干扰素α/β的同源性较低(约30%)[3]。虽然干扰素ε也通过与Ⅰ型干扰素受体结合进行信号传导,但与干扰素α不同,传统PRR通路激动剂(病毒、细菌)不能诱导IFN-ε的表达[4-6]。干扰素ε反而在多种黏膜组织如肺、小肠、生殖道、睾丸、包皮等细胞和组织中组成性表达,即在这些组织中长时间维持较高的表达水平[4,6]。生物体还进化出了一套机制保证干扰素ɛ只能在产生部位发挥作用,不能分泌到其他组织而实现选择性。研究表明干扰素ε的表达由雌激素控制,其含量能随着雌性生理周期的改变进行调节,从而起到保护生殖道、避免其被病毒和细菌感染的作用[4]。进一步的研究表明干扰素ε还能被精液诱导表达[7]并阻断HIV的复制,且其作用机制不同于已知的其他类型干扰素[8]。

生物表达和化学合成是当前获取目标蛋白的主要技术手段,干扰素ε氨基酸序列过长导致化学合成[9]成本过高(约1万元/mg),本研究拟采用原核表达的方式获取人干扰素ε蛋白,从而为进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 基因、质粒和菌株

表达载体Ifn-ε/pET-21a (+)和Ifn-ε/pET-22b (+)由上海捷瑞生物工程有限公司构建,大肠杆菌BL21 (DE3)、Rosetta (DE3)和Origami B (DE3)由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司;琼脂购自Generary公司;30% Acr-Bis (29∶1)、1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)、1.0 mol/L Tris-HCl (pH 6.8)购自Beyotime公司;四甲基乙二胺购自国药集团化学试剂有限公司;NaCl购自江苏强盛功能化学股份有限公司;NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·2H2O、乙二胺四乙酸二钠、β-巯基乙醇、过硫酸铵、冰乙酸、异丙醇、仲丁醇购自南京化学试剂有限公司;CaCl2购自西陇化工股份有限公司;二硫代苏糖醇购自Aladdin公司;尿素、溴酚蓝、盐酸胍、考马斯亮蓝R-250购自Sigma公司;氨苄青霉素钠盐、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、甘氨酸购自Amresco公司;Tris购自Mybioscience公司;十二烷基硫酸钠购自Biosharp公司;Prestained Protein Ladder购自Thermo Scientific公司;无水乙醇购自上海Titan科学有限公司;乙腈购自TEDIA公司;三氟乙酸购自ROE SCIENTIFIC公司;葡聚糖凝胶填料购自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 基因合成和表达载体构建

从NCBI(NP_795372.1)上查找到hIFN-ε的氨基酸序列,共有208个氨基酸,去除前端21个氨基酸信号肽,得到由187个氨基酸构成的成熟hIFN-ε,对应碱基全长561 bp。5′端加上起始密码ATG和限制性内切酶NdeI的位点序列CA↓T;3′端插入终止密码TAA和限制性内切酶XhoI的位点序列C↓TCGAG;合成长度为576 bp的基因Ifn-ε载体序列,将其插入pET-21a (+)的NdeI (730)和XhoI (159)之间从而构建Ifn-ε/pET-21a (+) 质粒,委托Generay公司测序验证正确性。

考虑到不同细胞内可用tRNAs量的差异,可能会导致人源干扰素ε(hIFN-ε)密码子在外缘宿主大肠杆菌体内的利用率较低而出现表达量低,甚至抑制表达的现象。本研究同时合成了经过密码子优化的人源干扰素ε基因,即在不改变氨基酸序列的前提下将低利用率的密码子替换为大肠杆菌常用密码子从而达到提高功能蛋白表达水平的目的,具体见图1(5′→3′)。再将优化后的基因同上方法构建Ifn-ε/pET-22b (+) 质粒,并做测序验证。

图1 人源干扰素ε密码子优化前后的基因

1.2.2 表达菌的构建和培养条件优化

将上述2个质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3)、Rosetta (DE3)和Origami B (DE3),涂布含有氨苄青霉素的LB平板。挑取单克隆转化子于5 mL LB液体培养基的试管中,按照1∶1 000的比例加入氨苄青霉素(终浓度为100 μg/mL),37 ℃振荡培养。扩增3 h后按照1∶100的比例加IPTG(终浓度为1.0 mmol/L)诱导,37 ℃诱导培养6 h后收集菌体,进行SDS-PAGE电泳,比较蛋白表达情况,选取表达量较高的作为优势菌。

IPTG浓度优化:设置5个IPTG浓度(0、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L),37 ℃扩增培养3 h后收菌,制样电泳。诱导时间优化:设置5个诱导时间(2、3、4、5、6 h),即从诱导培养的第2小时,每间隔1 h取菌液,进行电泳分析。扩增温度、诱导温度优化:将优势表达菌接种至4个LB液体培养基(编号为①～④),培养3 h至菌液浑浊,按最适IPTG浓度诱导培养。Ifn-ε/pET-21a (+)为质粒表达菌:①～④三角瓶扩增温度分别为37、37、42和42 ℃;诱导温度分别为37、42、37和42 ℃。Ifn-ε/pET-22b (+)为质粒的表达菌:①～④三角瓶扩增温度分别为30、37、30和37 ℃;诱导温度分别为30、37、37 和30 ℃。

1.2.3 表达形式的确定

各表达菌按优化所得培养条件,扩增培养3 h后加IPTG诱导培养6 h,离心弃上清液得菌体沉淀部分。菌体沉淀用20～30 mL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 溶液吹散,超声破菌,12 000 r/min离心10 min。(1)上清液部分:取50 μL上清液,加入50 μL 2 × loading buffer,100 ℃煮5 min。(2)沉淀部分:沉淀用50 μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 溶液吹散,加入50 μL 2 × loading buffer,100 ℃煮5 min。上清液、沉淀的样品都离心10 min,12 000 r/min,30 ℃,离心后取上清液上样,进行电泳。若大肠杆菌以可溶性形式表达蛋白,则在上清液中可以检测到目的蛋白;若是以包涵体形式表达蛋白,则会在菌体沉淀中检测到目的蛋白。

1.2.4 目标蛋白的分离纯化

(1)葡聚糖Sephadex G100凝胶过滤色谱。将从表达菌中获得的包涵体沉淀洗涤纯化后用包涵体溶解液(10% SDS,0.1 mol/L PBS,10 mmol/L DTT,1 mmol/L EDTA)溶解后,离心取上清液进行葡聚糖Sephadex G100凝胶柱层析纯化。用0.1 mol/L PBS缓冲液洗脱,分段收集、冻干、电泳验证。(2)高效液相色谱法。流动相:H2O (0.1% TFA),乙腈(0.1% TFA);制备色谱柱:Waters Symmetry300TMC4,5 μm,OBDTM19 mm×250 mm; 分析色谱柱:Waters Xbridge BEH C4,3.5 μm,4.6 mm×150 mm,300 Å;检测波长:210 nm。分段收集,质谱分析。(3)质谱测试:采用ESI+-TOF-MS对目标蛋白的分子量进行验证。

2 结果与分析

2.1 重组质粒验证

按照表达质粒Ifn-ε/pET-21a (+)和密码子优化后的质粒Ifn-ε/pET-22b (+)设计要求人工合成目的基因。根据Generay公司提供的质粒综合序列测序图,显示表达质粒的序列正确。用NdeI/XhoI对质粒进行双酶切,凝胶电泳图显示条带在500～750 bp,与目标条带569 bp相一致。结果表明目的基因Ifn-ε已成功连接到pET-21a (+)和pET-22b (+)载体中。

2.2 抗生素筛选

结果表明,含有Ifn-ε基因的pET-21a (+) 和pET-22b (+) 质粒均已成功转入相应的大肠杆菌,见图2。

(a)～(f)为Ifn-ε/pET-21a (+)和Ifn-ε/pET-22b (+)分别转化BL21 (DE3)、Rosetta (DE3)、Origami B (DE3)后的转化子生长示意图。

2.3 优势表达菌的筛选和培养条件优化

表达质粒Ifn-ε/pET-21a (+)和Ifn-ε/pET-22b (+)分别转化3株大肠杆菌BL21 (DE3)、Rosetta (DE3)、Origami B (DE3)获得表达菌后,电泳分析结果表明BL21 (DE3)菌的表达量相对较高,因此,选其作为两个载体的优势菌。

重组菌Ifn-ε/pET-21a/BL21以37 ℃扩增培养3 h后测试5个IPTG浓度和5个诱导时间对目标蛋白表达量的影响。电泳结果表明干扰素ε蛋白条带随着IPTG浓度和时间的增加而增加,直至5、6 h时变化不大。综合考虑确定Ifn-ε/pET-21a/BL21的最佳IPTG浓度为1 mmol/L,扩增3 h后诱导6 h。随后对扩增温度和诱导温度(37 ℃,42 ℃)进行组合优化,结果表明42 ℃时表达菌扩增速度快,菌体数目多,目标蛋白较早表达,且量也较高,但随着诱导时间延迟,蛋白有所减少,推测可能是因为温度过高时表达的蛋白不稳定被降解。而在37 ℃条件下,蛋白量不断增加,且没有降低的趋势,因此,选择37 ℃扩增再以37 ℃诱导培养条件作为表达菌培养条件,该培养条件下两株菌的电泳结果见图3。

图3 培养条件优化后电泳图

2.4 表达形式的确定

在最佳条件下小批量发酵两株优势表达菌Ifn-ε/pET-21a/BL21和Ifn-ε/pET-22b/BL21,超声裂解处理菌体,电泳检测裂解后的上清液和沉淀部分。结果表明,两株菌的干扰素ε目标蛋白都在沉淀样品里,而上清液部分均未观察到目标蛋白条带,即两株表达菌都以包涵体形式表达目的蛋白。

2.5 目标蛋白的分离纯化

两株优势表达菌在最优条件下放大发酵,PBS裂解液超声破碎后,离心后沉淀得包涵体部分各约500 mg。经纯化收集后冻干,电泳检测。结果表明:Ifn-ε/pET-21a/BL21的包涵体用Sephadex G100纯化后,与杂蛋白一起被洗脱,分离效果较差且目的条带很弱。相比之下Ifn-ε/pET-22b/BL21的包涵体经凝胶纯化后主要部位中只有两个主要的杂蛋白,且目的条带较明显。因此,取从Ifn-ε/pET-22b/BL21凝胶纯化得来的目标蛋白部位进一步使用制备型HPLC纯化(流动相A:含0.1% TFA的水;流动相B:含0.1% TFA的乙腈;检测波长:220 nm;梯度:0～60 min内B相比例10%增加到50%),然后分段接收流出液,进质谱扫描确认样品峰的位置,随后再进液相检查各份样品峰纯度,进行合并冷冻干燥。最终分离纯化得到的干扰素ε蛋白的电泳图和色谱图见图4。

图4 干扰素ε的电泳图和色谱图

2.6 目标蛋白的质谱分析

用ESI质谱测定目标蛋白分子量,正离子扫描范围600～1 500,质谱图见图5。干扰素ε蛋白由187个氨基酸构成[10],加上起始氨基酸(甲硫氨酸),共188个氨基酸,理论分子量为22 224.68,实测分子量为22 224.89,对应的多电荷峰:[M+17H]17+=1 308.365 3,[M+18H]18+=1 235.697 8,[M+19H]19+=1 170.735 0,[M+20H]20+=1 112.251 6,[M+21H]21+=1 059.330 1,[M+22H]22+=1 011.233 5,[M+23H]23+=967.307 4,[M+24H]24+=927.046 1,[M+25H]25+=889.990 7,[M+26H]26+=855.816 3,[M+27H]27+=824.115 5,[M+28H]28+=794.763 1,[M+29H]29+=767.348 0,与理论预测值完全相符。

3 结论

(1)将表达质粒Ifn-ε/pET-21a (+)、Ifn-ε/pET-22b (+) 转化入BL21 (DE3)、Rosetta (DE3)和Origami B (DE3)等3类大肠杆菌,结果表明BL21 (DE3)表达菌产生的目的蛋白量最高。(2)通过对扩增温度、诱导温度、诱导时间和IPTG浓度进行优化,筛选出两株优势表达菌Ifn-ε/pET-21a/BL21和Ifn-ε/pET-22b/BL21。优化后确定的表达条件:IPTG 终浓度为1.0 mmol/L,扩增温度和诱导温度均为37 ℃,诱导6 h。(3)两株表达菌均以包涵体形式表达目标蛋白,包涵体难溶于8 mol/L尿素和6 mol/L盐酸胍,但易溶于SDS;通过制备液相对包涵体进行纯化,成功地从Ifn-ε/pET-22b/BL21表达菌中得到了高纯度的IFN-ε。(4)表达菌Ifn-ε/pET-22b/BL21比Ifn-ε/pET-21a/BL21的蛋白表达产量高,可能是连接在表达载体pET-22b (+)的目的基因Ifn-ε经过密码子的优化,便于大肠杆菌识别和利用,使蛋白表达有所提高。(5)IFN-ε蛋白在飞行时间质谱ESI正离子模式下实测带电荷数为17～29,其理论分子量和质谱测试结果完全吻合。

综上,本研究采用基因合成、密码子优化、表达菌筛选、培养和纯化条件摸索、电泳和质谱验证,成功构建干扰素ε的表达体系。该工作的完成为后期以表达的方式对蛋白氨基酸序列进行突变进而研究构效关系奠定基础。