南海中南部金带细鲹与长体圆鲹矢耳石外型比较分析

李伟畅,朱国平,王雪辉,林龙山,李 渊,杜飞雁

(1.上海海洋大学 海洋科学学院,上海 201306;2.中国水产科学研究院南海水产研究所,广州 510300; 3.自然资源部第三海洋研究所海洋生物与生态实验室,厦门 361005;4.上海海洋大学 极地研究中心,上海 201306;5.大洋渔业资源可持续开发教育部重点实验室极地海洋生态系统研究室,上海 201306;6.农业农村部海洋牧场重点实验室,广州 510300;7.国家数字渔业(海洋牧场)创新分中心,广州 510300)

鲹科(Carangidae)隶属辐鳍亚纲(Actinopterygii)、鲈形目(Perciformes),广泛分布于东海、南海、印度洋和西太平洋等海域,是南海渔业的重要捕捞对象之一[1-2]。鲹科鱼类属中上层洄游性鱼类,在春、夏季进行产卵洄游,但不作长距离游动,仅限于在深水和浅水之间[3]。由于南海海域广阔、生存条件适宜,鲹科鱼类成为我国南海重要的渔业资源[4]。

鱼类内耳中存在3对耳石,分别为矢耳石(sagittae)、星耳石(asteriscus)和微耳石(lapillus),位于囊状结构内[5]。矢耳石为大多数硬骨鱼中最大的耳石,已被广泛用于研究鱼类的种类鉴定、种群判别和年龄与生长等方面[6]。耳石形态差异一直被认为是确定鱼类种群的有效工具[7],并成功用于各种小型中上层鱼类如沙丁鱼(Sardinesspp.)、欧洲鳀(Engraulisencrasicolus)、大西洋鲱鱼(Clupeaharengus)、鲐(Scomberjaponicus)、大西洋鲑(Salmosalar)等的种群鉴定[8-9]。此外,耳石形状分析也有助于描述一定地理范围内同种鱼类的耳石变化。如魏联等[10]分析发现南设得兰群岛外侧水域的次南极电灯鱼(Electronacarlsbergi)耳石分为4种类型,且左、右耳石类型存在差异;李史民等[11]研究发现南设得兰群岛南极电灯鱼(Electronaantarctica)耳石的生长更趋向于厚度的增加。目前,利用耳石外型进行物种鉴别主要有传统形态测量法和几何形态测量法。传统形态测量法具有操作简便、容易掌握、不需要复杂工具等特点,而几何形态测量法可较好地提取和分析耳石形状信息,其主要采用椭圆傅里叶分析。椭圆傅里叶分析法可提供耳石形状的正弦和余弦形式的函数[12],在区分群体单位和获取重要信息方面快速、客观。此外,高质量图像和形状信息获取技术的快速发展,以及统计能力的快速提升[13],使快速而又准确地采集大量耳石数据成为可能。

国内对南海鲹科鱼类的研究主要集中于其数量分布[14]、种群生物学[15-16]、产卵场[14]和渔业声学资源评估[2]。在摄食生态学和系统分类学等领域,由于摄食动物胃含物中鱼类外部形态无法识别,而耳石形态具有种间特异性、不易被消化和数据获取简单等特点,其常被用于胃含物中鱼类的种类鉴定[17]。南海鲹科鱼类矢耳石的形态特征也有过报道,但主要是根据其耳石形态建立对鲹科鱼类的分类检索表[18]。机器学习算法比传统分类模型更灵活,能够处理具有非线性关系或具有相互作用的生物数据,在解决鱼类物种和种群分类方面具有巨大的潜力[19]。然而,目前国内机器学习分类在基于耳石形状区分鱼类物种和种群方面的应用是有限的。基于不同机器学习算法,对南海鲹科鱼类矢耳石进行种群结构和种群分类的相关研究尚未有报道。运用主成分分析、线性判别分析和随机森林算法已有相关研究报道[7,20]。而K-最近邻算法是简单和直观的非参数分类过程,其优势之一是其对数据结构具有较高容忍度[21],可应用于多类问题的分析。通过选择出最适的K值和计算训练集与测试集特征值之间的距离,来选出K个距离最近的分类[22]。支持向量机能够处理高维数据集并灵活地对各种数据源建模,该算法使用核函数将预测变量投影到更大维度的特征空间中,从而可以构建线性模型[23]。为此,本文通过形态学方法和傅里叶分析方法对两种鲹科鱼类的矢耳石形态特征进行研究,分析两种鲹科鱼矢耳石形态学参数差异,并对矢耳石各形态学参数与鱼体叉长进行拟合,通过主成分分析、线性判别分析、随机森林、支持向量机和K-最近邻算法比较研究两种鲹科鱼矢耳石轮廓特征,并分析了这些方法对鲹科鱼类矢耳石的分类效果,以期为日后在南海鲹科鱼类耳石方面的深入研究积累基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

样本采集于2019年6—7月中国南海中南部海域,金带细鲹(Selaroidesleptolepis)和长体圆鲹(Decapterusmacrosoma)共108尾。样本冷冻保存后运回实验室进行研究。测量其叉长(fork length,FL)、体质量(total weight,TW)等数据,其中,叉长精确至0.1 cm,体质量精确至0.01 g,并利用镊子和解剖刀将耳石取出。选取金带细鲹共64尾,取得完整左耳石64枚,右耳石64枚;选取长体圆鲹共44尾,取得完整左耳石44枚,右耳石41枚。通过t检验发现,两种鲹科鱼的左、右耳石均无显著性差异(P>0.05),因此,选取左耳石进行分析。本研究鱼类生物学数据如表1。

表1 金带细鲹和长体圆鲹样本生物学信息

1.2 耳石处理及形态测量

利用超纯水和超声波清洗机将鱼体内取出的矢耳石进行清洗,将耳石干燥后放入离心管内保存。将左耳石放置在反射光下的黑色背景上,并调整方向以满足R包“ShapeR”的要求[12]。根据耳石的大小调整立体显微镜的放大倍数,在OLYMPUS SZ61型解剖镜下进行拍照,利用Digimizer软件测量耳石高(otolith height,OH)、耳石长(otolith length,OL)、耳石面积(otolith area,OA)和耳石周长(otolith perimeter,OP),结果精确到0.001 mm。

1.3 外型分析

1.3.1 形态指标分析

参考文献[24-26],对金带细鲹和长体圆鲹耳石的耳石高、耳石长、耳石面积和耳石周长等4个形态学参数进行测量,将4个形态学参数通过公式转换为6个耳石形态指标,即环率(circularity)、圆度(roundness)、幅形比(aspect ratio)、形态因子(form factor)、矩形趋近率(rectangularity)和椭圆率(ellipticity)。

1.3.2 椭圆傅里叶分析

椭圆傅里叶分析法原理是利用数学表达式系数来对耳石形态轮廓进行描述和分析,具体处理过程参见文献[12]。其将耳石的闭合二维轮廓分解为一系列封闭曲线(即谐波),每个谐波由4个傅里叶描述子系数构成,即an、bn、cn、dn,其中n代表谐波数量,共产生4n个傅里叶描述子系数[27]。使用ShapeR软件包读取耳石图片,提取了12组傅里叶谐波,由耳石整体形态轮廓中提取了48个椭圆傅里叶描述子系数。在系数提取过程中,第一组谐波的前3个值被设为定值,并以叉长作为协变量,利用协方差分析消除叉长对耳石形状的影响。最终,本研究中每个耳石整体形态轮廓由44个椭圆傅里叶描述子系数构成,用于后续的主成分分析及判别分析。

1.4 数据处理

对提取出的数据进行标准化,并利用Shapiro-Wilk(S-W)检验其正态性,对符合正态分布的数据进行均值相等性检验及单因子方差分析(ANOVA)检验。根据符合检验标准的耳石尺寸参数,拟合耳石各个形态学参数与叉长的函数关系,R2值最大者为最适合函数[28-29]。并通过配对样本t检验探究耳石各形态学参数和指标的差异性。对满足检验标准的椭圆傅里叶系数进行主成分分析(principal component analysis,PCA),得出前20个主成分的贡献率,再运用线性判别分析法(linear discriminant analysis,LDA)、随机森林(random forest,RF)、支持向量机(support vector machines,SVM)和K-最近邻(K-nearest neighbor,KNN)对两种鲹科鱼种耳石形态进行判别,得到正确率。将样本分为训练样本和测试样本,训练样本占总样本的80%,测试样本占总样本的20%,其中随机森林的分类树为500,K-最近邻的K值取2,支持向量机的核函数为linear。以上所有数据的分析处理及统计学研究使用R 4.1.0和Excel 2010软件完成,PCA、LDA、RF、SVM和KNN分别采用R 4.1.0程序中的FactoMineR、MASS、RandomForest、e1071和class包实现。显著性水平为P=0.05。除非另有说明,所有数据均以平均值±1倍标准差表示。

2 结果与分析

2.1 耳石与形态测量分析

2.1.1 耳石尺寸参数与叉长关系

金带细鲹和长体圆鲹耳石的基叶和翼叶分化明显,耳石形状呈长椭圆形,并且随着其叉长的增长而增长,耳石周围存在较多脊突,裂沟与基叶和翼叶之间的主间沟清晰可见,裂沟从主间沟一直向后延伸并于耳石后部向下弯曲。由图1(a)可知,金带细鲹矢耳石周围脊突发育明显,耳石背部和耳石腹部发育表现为向外凸出,基叶和翼叶之间的主间沟发育不明显,基叶发育呈现略短且粗壮,翼叶仅有一点小的突起。长体圆鲹耳石背部存在较多明显脊突,基叶和翼叶之间有较为明显的主间沟,基叶和翼叶发达且末端较尖锐[图1(b)]。

(a)金带细鲹;(b)长体圆鲹。

t检验结果显示(表2),金带细鲹和长体圆鲹的耳石高(OH)、耳石长(OL)、耳石面积(OA)与耳石周长(OP)这4项指标均存在极显著性差异(P<0.01)。

表2 金带细鲹及长体圆鲹耳石尺寸参数比较

金带细鲹和长体圆鲹耳石各尺寸参数与叉长之间的关系均呈幂函数关系(表3),且显示各形态尺寸与叉长间均存在极显著的相关性 (P<0.01)。通过幂函数关系可以看出,金带细鲹和长体圆鲹的耳石大小均会随叉长、年龄的增长而增大。

表3 金带细鲹和长体圆鲹叉长与耳石形态参数间的函数关系

2.1.2 耳石形状指标

通过观察耳石形状指标统计结果(表4),金带细鲹和长体圆鲹耳石形状指标存在极显著差异(P<0.01)。金带细鲹耳石形状比长体圆鲹更为规则,更趋近于圆,长体圆鲹的主间沟更为明显。环率表示耳石外型轮廓趋于圆的程度,其值越小,耳石轮廓就越趋近于圆。金带细鲹环率明显低于长体圆鲹,在一定程度上表明金带细鲹耳石更趋近于圆。形态因子表示耳石的规则程度,耳石轮廓越规则,形态因子参数值就越大。长体圆鲹的形态因子均值低于金带细鲹,表明金带细鲹耳石形状更为规则。

表4 金带细鲹和长体圆鲹耳石形态参数比较

2.2 主成分分析

PCA结果显示,第一主成分和第二主成分因子的贡献率分别为20.1%和13.3%。由主成分因子分布图可以看出(图2),金带细鲹和长体圆鲹的耳石在第一因子上可进行很好地区分,仅少量重叠存在于第一因子和第二因子之间,具有比较好的区分效果。

图2 基于椭圆傅里叶谐波的金带细鲹和长体圆鲹耳石第一和第二主成分因子分布图

2.3 判别分析

根据符合检验标准的傅里叶描述子系数(均值相等性检验,单因素方差分析,P<0.05),对金带细鲹和长体圆鲹的矢耳石进行判别分析。从判别结果来看,随机森林的判别效果是最好的,对鲹科鱼类耳石形态的判别正确率达到100%,效果最差的是支持向量机,原因是在测试集中有3个样本被错误分类,但总体判别效果较好,训练样本的判别正确率达到了100%,测试样本的判别正确率为86.67%(表5)。

表5 金带细鲹和长体圆鲹耳石整体形态的判别分析结果

3 讨论与结论

3.1 耳石形态学

通过对两种鲹科鱼类的矢耳石形态进行分析,金带细鲹和长体圆鲹的耳石形状均呈长椭圆形,具有较发达的基叶和翼叶,且随着其叉长的增长而增长,耳石周围存在较多脊突,裂沟与基叶和翼叶之间的主间沟清晰可见。其他科鱼种如阿拉斯加狭鳕(Gaduschalcogrammus)矢耳石的形态呈椭圆形,主间沟不较为明显,而翼叶与基叶比较发达[27];南极小带腭鱼(Cryodracoantarcticus)的矢耳石形状较规则,趋近于矩形,背部和腹部边缘较光滑平整[28]。以上耳石研究说明本研究中的两种同科鱼类耳石形态在某种程度上具有一定的相似性,而相较于非此科鱼类的耳石形态,两者具有明显差异。

通过测量和计算金带细鲹和长体圆鲹耳石的4种形态学参数和6个形态指标,对两种鲹科鱼类的耳石形态进行分析。结果表明,两种鲹科鱼类的耳石高、长、面积、周长和各项形态指标均呈极显著性差异:金带细鲹耳石形状更规则,更趋近于圆,耳石基叶发育呈现为略短且粗壮,翼叶仅有一点突起;长体圆鲹主间沟明显,基叶和翼叶发达且末端较尖锐。研究表明,除了遗传因素外两种鱼类的生活习性不同也是造成以上差异的原因。长体圆鲹在开放水域聚集或成群洄游,栖息水深一般为20～170 m,而金带细鲹主要栖息于近海大陆架区域(水深50～70 m),并于松软地质的水域成群洄游[29-31]。

耳石在鱼类年龄与生长等方面的应用广泛,然而耳石大小与鱼体大小的关系在不同鱼类之间具有特异性[6]。本研究结果表明,两种鲹科鱼类耳石高、长、面积、周长均随叉长的增长而增长或变大。在耳石形态学参数与鱼类叉长的拟和过程中,幂函数为各个耳石形态学参数与长体圆鲹叉长的最适拟和函数,并且拟合效果较好(R2>0.5)。欧利国等[32]对南海东沙群岛海域的56尾长体圆鲹耳石测量后表明,其耳石长与叉长的关系式为FL=30.065OL-54.293(R2=0.433),其样本叉长范围为16.4～24.6 cm。上述结果与本文研究结果虽有所不同,但可得出长体圆鲹耳石长随叉长的增长而增长。

鱼类耳石形态受到遗传因素和环境因素的共同影响,栖息于不同地区的同种鱼耳石形态受到的影响主要来自于环境因素[33-34]。鱼类外型对耳石形态也有一定的影响,南海鲹科鱼类从秋季到春季洄游,每到繁殖期(一般为春夏季),鲹科鱼类会洄游到特定海域产卵,可能在此因素的影响下一些鱼体的外形为流线型,并促使其耳石整体也呈现流线型[35],鲹科鱼类矢耳石形态特征可能是遗传因素和生活环境共同作用的结果。

3.2 耳石傅里叶分析

耳石由碳酸钙和其他无机盐构成,结构较为稳定,通常形成后就不易发生改变。耳石易受到鱼类所在环境和栖息地强烈影响,并且在测量时具有数据易获取、数据处理过程简单等优点,因此,耳石传统形态测量学被广泛用于鱼类种群的识别和捕食者食性分析。然而,传统形态测量学并不是保证所有鱼类物种正确分类的好方法[36]。第一,形状指标由形态学参数通过公式转换得到,因此,大多数形状指标具有强相关性,这就导致了多重共线性问题。形态指标之间的强多重共线性会限制分析过程中变量的数量,从而降低分类模型的准确度。第二,形状指标并不一定意味着对象的真实描述,在个体发育过程中,耳石形状会在剖面或整个轮廓上具有或多或少的突出和改变[37]。当突出和改变较小时,形状指数可能保持不变。因此,与肉眼明显不同的耳石可能会具有相似的形状指数值。

故本文利用几何形态测量法的椭圆傅里叶分析对耳石轮廓进行提取,使其在形态学上的分析更加具体和形象,并对两种鲹科鱼类进行种类判别。耳石外型轮廓提取出的前12组傅里叶谐波很好描述了耳石轮廓形状。主成分因子分布图显示,金带细鲹和长体圆鲹耳石形态的椭圆傅里叶描述子系数的前2个主成分的贡献率分别为20.1%和13.3%,随着主成分增加,低值的主成分对耳石整体形态轮廓变化产生的影响较大[38],由主成分因子的分布图可以看出第一主成分和第二主成分间有部分重叠,且在第一因子方向上可进行较好区分,整体区分效果相对较好。耳石形态特征分析已成功用于黑线鳕(Melanogrammusaeglefinus)、大西洋鳟(Oncorhynchusketa)等鱼类的种群判别,结果显示研究耳石形态特征是鉴别鱼类种群的一种有效方法[39]。同时由于耳石具有高特异性、易保存和不易被消化等特点,耳石形态分析也在捕食者食性分析、确定鱼类的年龄和生长、古生态学、古生物地理学、系统发育,鱼类的生活史和营养生态学研究等方面得到了广泛运用[18,40]。虽然傅里叶分析法获取数据比传统形态学测量法更加复杂,但其在分析过程中可以尽量消除耳石位置、大小等差异和人工测量产生带来的误差,是一种更好的分析方法[35,39]。在本研究中,随机森林的判别精度最高,达到了100%,并且其他模型也都具有较好的准确性,表明机器学习算法是一种有效的分类方法,其基于傅里叶分析在耳石形状对物种和种群鉴定方面有着较好的效果。不同机器学习算法的性能依据具体情况而定,其效果随数据集中类别数量、组间相似性和变量数量的不同而变化[19],因此,我们建议在判别研究中需测试一系列分类器,以提高判别的准确性。本文利用耳石形态对南海金带细鲹和长体圆鲹两种鲹科鱼类进行研究并基于不同机器学习算法对其进行判别,为日后南海鲹科鱼类耳石的种间差异及个体识别积累了基础数据,也为今后对南海鲹科资源的研究和保护提供了帮助。但目前对其种群结构的研究较少,在今后的研究中可结合年龄与生长和耳石微化学等方法开展对南海鲹科鱼类的种群研究。

致谢：感谢王守信、陈盟基、黎红、柯兰香、符丽雅和王佳燕等在样本生物学测定和耳石提取过程中的帮助。感谢魏联、陈毓雯和曹丹在数据处理方面的帮助。感谢国家远洋渔业工程技术研究中心、农业农村部外海渔业开发重点实验室、中国水产科学研究院海洋牧场技术重点实验室、广东省海洋休闲渔业工程技术研究中心和农业农村部南海渔业资源环境科学观测实验站提供样本、实验仪器和设施。