骨桥蛋白和铁调素在干燥综合征及狼疮患者组织中的表达

刘娟 郭华 孙敏 付萍

[摘要]目的：通過蛋白芯片技术筛选血清中的2个结果蛋白做免疫组化（Immunohistocry，IH）研究，检测其在干燥综合征（Sj?grens syndrome，SS）患者唇腺组织、系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）患者皮损及狼疮性肾炎（Lupus nephritis，LN）患者肾脏组织中的表达情况。方法：收集2004年1月-2013年12月就诊于风湿免疫科患者的组织蜡块43例，按照不同疾病、不同部位将组织蜡块分为SS组16例、非SS对照组10例、SLE皮损组9例、LN组8例。采用免疫组织化学染色法检测骨桥蛋白和铁调素在SS患者、SLE患者皮损和LN患者肾脏组织中的表达。使用Fromowitz的综合计分法进行结果判定。阳性率的比较采用四格表确切概率法。结果：骨桥蛋白和铁调素在SS唇腺组织的表达均高于非SS唇腺组织，两种蛋白在SLE皮损中未液化的少量基底层细胞中见阳性表达、狼疮肾组织中肾小管上皮细胞见阳性表达。结论：骨桥蛋白与铁调素可在干燥综合征患者唇腺组织、系统性红斑狼疮患者皮损及狼疮性肾炎患者的肾小管中表达。

[关键词]干燥综合征；免疫组化；骨桥蛋白；铁调素；系统性红斑狼疮

[中图分类号]R365    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）05-0096-04

The Expression Both of Osteopontin and Hepcidin in the Tissue of Sj?grens Syndrome and Systemic Lupus Erythematosus Patients

LIU Juan1，GUO Hua1，SUN Min1，FU Ping2

（1.Department of Dermatology，Huishan People's Hospital of Wuxi，Wuxi 214187，Jiangsu，China; 2.Department of Rheumatology and Immunology，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650101，Yunnan，China）

Abstract： Objective  The immunohistochemical method was applied to text two proteins screened through SELDI-TOF-MS from serum. To test the expression in the labial gland tissue of SS patients，the skin lesion of Systemic Lupus Erythematosus and renal tissue in LN patients. Methods  Collection forty-three tissue wax blocks from the patients who treated in the department of rheumatology and immunology during January 2004 to December 2013. The tissue wax blocks were divided into SS group（n=16）， non-SS control group（n=10）， SLE skin lesion group（n=9）and LN group（n=8） accord different disease and different position.Used the immunohistochemical staining to test the expression in the labial gland tissue of SS patients， the skin lesion of Systemic Lupus Erythematosus and renal tissue in LN patients.Used the Fromowitz comprehensive scoring method to assess the results. The comparison of two kinds of protein staining positive rate used the four table exact probability. Results  Osteopontin and hepcidin in the expression of SS labial gland tissue were higher than non-SS labial gland tissue， was detected in the lesions of SLE did see positive expression in a small amount of liquid base layer cells， lupus kidney tissues in renal tubular did see positive expression. Conclusion  Osteopontin and hepcidin were expressed in labial gland tissue of SS， skin lesion of SLE and lupus kidney patientsrenal tubules of LN.

Key words： sj?grens syndrome; immunohistochemical; osteopontin; hepcidin; systemic lupus erythematosus

SS是一种以淋巴细胞浸润累及全身外分泌腺，主要侵犯泪腺和唾液腺为主的弥漫性慢性自身免疫性疾病。骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）是具有多种功能的分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，OPN可表达于巨噬细胞、中性粒细胞、DC、T、B淋巴细胞等作为一种前炎性细胞因子，参与免疫反应[1]。OPN与SLE相关研究已有报道，但与SS相关研究报道较少；铁调素（Hepcidin，Hepc）是铁代谢的主要调节激素，目前OPN和Hepc在干燥综合征的研究中报道较为罕见。本研究通过蛋白芯片技术筛选血清中的2个结果蛋白进一步做唇腺组织免疫组化研究，检测其在SS患者唇腺组织、SLE患者皮损及LN患者肾脏组织中的表达情况。现将结果报道如下。

1  资料和方法

1.1 临床资料：收集2004年1月-2013年12月就诊于昆医附二院满足2002年国际分类标准确诊为干燥综合征16例患者的唇腺蜡块作为SS组，男1例，女15例，年龄20～72岁，平均年龄（46.94±13.57）岁；收集2004年1月-2013年12月就诊于昆医附二院患者做唇腺活检为正常唇腺组织的唇腺蜡块，即不符合SS诊断标准的唇腺组织蜡块10例，作为非SS对照组，男3例，女7例，年龄44～68岁，平均年龄（57.78±8.35）岁，两组患者在年龄、性别上对比，差异无统计学意义；收集满足2009年美国风湿协会SLE诊断标准确诊为系统性红斑狼疮患者的皮损蜡块9例，作为SLE皮损组：男1例，女8例，年龄12～59岁，平均年龄（35.44±15.85）岁；狼疮性肾炎肾脏组织蜡块8例作为LN组：男3例，女5例，年龄16～45岁，平均年龄（26.0±9.34）岁，两组患者在年龄、性别上对比，差异无统计学意义。

1.2 试验试剂：一抗为兔抗骨橋蛋白抗体（BYK-0019R）和兔抗铁调素抗体（BYK-8870R），均采购于上海博研生物有限公司（Abcam）；二步法抗为兔鼠通用型免疫组化试剂盒（GK500710，Gene Tech）。

1.3 方法：骨桥蛋白、铁调素免疫组织化学染色采用Envision二步法。以PBS液代替一抗的免疫组织化学染色的结果为阴性对照；以唇腺腺泡细胞、导管细胞和肾小管细胞胞浆着色作为OPN与Hepc的判断依据；结果评估参照Fromowitz的综合计分法进行，进行双盲半定量分析。以细胞膜或胞浆出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞，无着色或与背景颜色一致为阴性细胞。随机选择5个高倍镜视野，计数滋养细胞总数和阳性细胞总数，得出阳性细胞百分率及计分。无阳性细胞为0分，阳性细胞百分率1%～25%为1分，26%～49%为2分，≥50％为3分；根据多数细胞的着色强度计算强度得分，无着色为0分，浅棕褐色为1分，棕褐色为2分，深棕褐色为3分；阳性率和强度计分相加后的结果：0～1分为（-），2分为（+），3～4分为（++），5～6分为（+++）。

1.4 统计学分析：采用SPSS 13.0软件进行数据的统计学处理。样本OPN表达阳性率的比较采用Fisher确切概率法。

2  结果

2.1 SS组、非SS组唇腺组织中OPN的免疫组化染色结果：SS组骨OPN免疫组化的组织切片可见在导管上皮细胞和腺泡细胞（主要为导管上皮细胞）的胞浆中有棕黄色颗粒即呈阳性表达，少量基底层细胞也存在阳性表达；非SS组在部分导管上皮细胞和腺泡细胞上皮细胞胞浆中可见淡黄色颗粒；SS唇腺的阴性对照片无阳性表达。见图1。

2.2 SS组、非SS组唇腺组织中Hepc的免疫组化染色结果：SS组Hepc免疫组化的组织切片可见在导管上皮细胞和腺泡细胞（主要为导管上皮细胞）胞浆中有棕黄色颗粒即呈阳性表达，少量基底层细胞也有阳性表达；非SS组在部分导管上皮细胞和腺泡细胞上皮细胞胞浆中可见淡黄色颗粒；SS唇腺的阴性对照片无阳性表达。见图2。

2.3 OPN和Hepc在SS组唇腺组织阳性率的统计分析：SS组唇腺组织中OPN的阳性率为87.5%（14/16），Hepc的阳性率为81.3%（13/16），OPN和Hepc的阳性率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。在非SS组中OPN和Hepc的阳性率均为30.0%（3/10）。OPN在SS组阳性率高于非SS组中（P＜0.05），Hepc在SS组阳性率高于非SS组（P＜0.05）。16例SS中有12例共同表达OPN和Hepc。见表1。

2.4 SLE皮损中OPN和Hepc的免疫组化染色结果：OPN和Hepc在SLE皮损未液化的少量基底细胞中均可见阳性表达，差异无统计学意义，汗腺导管上皮细胞未见阳性表达。见图3。

2.5 LN组肾脏组织中OPN和Hepc的免疫组化染色结果：OPN和Hepc在LN狼疮肾脏组织的大量肾小管上皮细胞中均可见阳性表达，肾小球中无表达。见图4。

2.6 OPN和Hepc在LN组肾脏组织阳性率的统计分析：LN组肾脏组织中OPN的阳性率为62.5%，Hep的阳性率为75.0%，OPN和Hepc的阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。8例SS中有5例共同表达OPN和Hepc。见表2。

2.7 在OPN及Hepc两组蛋白的LN组肾脏组织每张切片中各选5张400×的视野图，算出100个细胞中阳性细胞的个数，并算出均值，对两组进行相关性分析，从输出的散点图可看出两个变量有线性趋势，其线性回归方程为y=0.995x+1.776，可认为OPN在肾小管上皮细胞的表达量与Hepc在肾小管上皮细胞的表达量呈正相关。见图5。

3  讨论

干燥综合征是以淋巴细胞对外分泌腺浸润为特征的自身免疫性疾病，主要产生IFN-γ的Th1细胞在SS患者的唇腺组织被发现，这些细胞刺激T、B淋巴细胞和巨噬细胞的活化，引起腺体结构破坏和功能障碍。

OPN是一种具有多种功能的分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，分布于多种组织，也可表达于多种免疫细胞如巨噬细胞、DC和淋巴细胞中，在免疫系统的疾病进程中发挥着重要的调节作用[2]。此前研究表明，应用SELDI检测干燥综合征患者的特异性差异蛋白中有骨桥蛋白[3]。王玉华[4]发现SS患者唇腺组织及浸润的淋巴细胞胞浆中OPN的mRNA转录和蛋白表达水平显著增高，吴国琳发现干燥综合征患者血清和唾液腺组织OPN表达增加[5]，本研究结果显示OPN在腺泡细胞和导管上皮细胞均有表达，提示OPN参与了SS的发病过程，但其机制不清。分析原因可能为，OPN在炎性刺激物的诱導下使Th细胞向Th1、Th2或Th17细胞偏移，同时OPN也是多克隆B细胞活化因可刺激巨噬细胞增殖活化，诱导前炎性细胞因子的分泌，引起组织损伤[6]，而B细胞是SS发病必不可少的因素，OPN可能通过多种方式诱发或加重了SS。

在米向斌[7]的研究中，活动期SLE患者血清中OPN水平明显增高，SLEDAI（SLE疾病活动指数）与血清OPN水平呈明显正相关；但是非活动期SLE患者和健康对照组血清OPN水平比较差异无统计学意义。而且，血清OPN水平与IL-17水平呈明显正相关。另一研究显示SLE患者血浆中OPN水平较正常健康人群显著增高，且处于活动期的SLE患者血浆OPN水平显著高于稳定期[8]。本实验中OPN在SLE皮损未液化的少量基底细胞中可见阳性表达。目前在基因层面Kaleta等[9]的研究表明，OPN_rs1126616 的杂合或纯合突变（707C/T）的个体具有更高的SLE易感性。国内研究表明，OPN基因的rs1126772、rs11728697和rs4754位点SLE发病风险无关[10]。SLE患者OPN基因rs9138和rsl1730582位点与SLE发病风险无关[11]。这些结果说明OPN的产生和SLE的炎性损伤和疾病进展密切相关其具体发病机制及致病基因位点有待进一步研究。

有实验研究在MRL/1pr小鼠狼疮肾炎的进展中显示，OPN可通过激活巨噬细胞和B细胞起重要作用，OPN在肾小管的表达可能提示狼疮性肾炎患者预后不良[12]。研究证实[5]OPN在LN肾小管的表达水平与正常肾组织相比有明显增高，尤以IV型LN为甚，其表达量与肾脏病理活动指数、肾损害临床指标及疾病活动度相一致。LN活动期患者血清中OPN水平高于缓解期[13]。OPN诱导的自身炎症反应间接促进补体C3的消耗，C3主要沉积于肾小球基底膜，参与肾小球的损害，从而导致OPN间接参与肾小球的损害[14]。本研究显示OPN仅在在LN患者的肾小管上皮细胞表达而在肾小球不表达，提示OPN可能不是LN发病的主要参与者，而是间接参与肾小球的损害，与上述研究一致。

铁调素是一种主要从肝脏合成的小肽，在脑、心脏、巨噬细胞、脂肪细胞也有少量的表达，经过剪切修饰等改变后具有25个氨基酸且存在生物活性。Hepc是一种II型急性期蛋白，与炎症、贫血和铁代谢的调节具有相关性[15]。在RA患者中由于IL-6的刺激和诱导作用，BMP-6及Hepc失去了对贫血和铁代谢的正常感应及调节作用，导致铁代谢紊乱及单纯性慢性病性贫血的发生[16]。在SLE患者中IL-6可通过STAT3途径和 HJV-BMP/SMAD信号通路调节Hepc的表达。有研究通过检测92例狼疮女患者的血清Hepc，得出血清Hepc与狼疮活动相关，可作为监测狼疮活动的指标[17]。尿液Hepc在LN患者组中的表达水平明显高于SLE无肾炎组和健康对照组；尿液Hepc在活动期LN患者组中表达水平显著高于静止期LN组，表明LN患者的尿液Hepc与SLEDAI评分呈正相关[18]。本研究结果显示Hepc在SS组和非SS组均有导管上皮细胞和腺泡细胞不同程度的表达，但与肾脏损伤没有明确的相关性，推测Hepc可能不是SS发病的驱动因素，可能是继发于损伤、感染和炎症刺激等引起Hepc基因的强烈表达的结果，这一假设有待今后继续研究。SLE患者血清Hepc与狼疮活动相关。尿液中Hepc在SLE肾脏受累的患者中表达水平升高，与本实验Hepc在SLE皮损未液化的少量基底细胞可见阳性表达；Hepc在LN狼疮肾脏组织的大量肾小管上皮细胞中可见阳性表达，提示Hepc可能是一种新的反映LN活动性的指标。

[参考文献]

[1]Lund S A，Giachelli C M，Scatena M.The role of osteopontin in inflammatory processes[J].J Cell Commun Signal，2009，3（3-4）：311-322.

[2]Spinelli F R，Garufi C，Truglia S， et al.The role of osteopontin as a candidate biomarker of renal involvement in systemic lupus erythematosus[J].Clin Exp Rheumatol，2019，37（6）：899-905.

[3]刘娟，付萍.干燥综合征蛋白组学的研究[J].昆明医科大学学报，2016，37（4）：65-70.

[4]王玉华，赵绵松，赵岩.舍格伦综合征患者唇腺组织中骨桥蛋白的表达[J].临床口腔医学杂志，2011，27（10）：579-581.

[5]Wu G L，Li T Y，Fan Y S，et al.Therapeutic effect of Chinese herbal medicine for strengthening qi，nourishing yin，and removing stasis on serum osteopontin and quality of life of patients with primary Sjogren's syndrome[J].Chin J Integr Med，2011，17（9）：710-714.

[6]Scatena M，Liaw L，Giachelli C M.Osteopontin：a multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27（11）：2302-2309.

[7]米向斌，罗妙旋，邱贤文，等.系统性红斑狼疮中白介素-27/骨桥蛋白调控轴在Th17细胞异常中的作用[J].中国皮肤性病学杂志，2014，28（8）：789-791.

[8]胡伟，生媛，徐学静，等.血浆骨桥蛋白水平与系统性红斑狼疮疾病活动性及肾脏损害的相关研究[J].现代医学，2017，45（11）：1591-1593.

[9]Kaleta B，Piotr M，Andrzej G，et al.The preliminary associ-ation study of osteopontin 707 C/T polymorphism with systemic lupus erythematosus in a Polish population[J].A Postepy Dermatol Alergol，2020，37（2）：190-194.

[10]陳新瑶，丁燕佳，梁雪雁，等.OPN基因多态性与潮汕人群女性SLE发病风险的相关性[J].分子诊断与治疗杂志，2021，13（3）：360-363.

[11]石缝，韦玉霞，庞晓霞，等.骨桥蛋白SNPrs9138和rs11730582与女性SLE发病风险的相关性研究[J].临床皮肤科杂志，2020，49（4）：195-199.

[12]Miyazaki T，Ono M，Qu W M，et al.Implication of allelic poly-morphism of osteopontin in the development of lupus nephritis in MRL/lpr mice[J].Eur J Immunol，2005，35（5）：1510-1520.

[13]李就鸿，张军，黄佩珍，等.系统性红斑狼疮肾炎患者血清骨桥蛋白表达的意义[J].中国现代医生，2012，50（34）：151-152.

[14]刘琼，李向培，胡白，等.SLE患者血清、尿液和肾脏骨桥蛋白的检测及临床意义[J].中华皮肤科杂志，2010，43（1）：6-9.

[15]唐代荣，廖湘平，李志湘，等.铁调素和狼疮性肾炎的相关性研究进展[J].当代临床医刊，2017，3（1）：2881-2883.

[16]邬秀娣，张振，陈勇，等.类风湿关节炎患者血清骨形态发生蛋白6和铁调素与贫血的关系[J].浙江医学，2013，35（18）：1632-1636.

[17]苏雯慧，黄克智，聂大年.狼疮患者的血清铁调素水平与狼疮活动的关系[J].医药界，2020，9（20）：161.

[18]唐代荣，谢先达，廖湘平.尿液中铁调素在系统性红斑狼疮中的临床意义[J].临床肾脏病杂志，2017，17（8）：490-494.

[收稿日期]2021-12-27

本文引用格式：刘娟，郭华，孙敏，等.骨桥蛋白和铁调素在干燥综合征及狼疮患者组织中的表达[J].中国美容医学，2023，32（5）：96-99.