乙醇熏蒸处理对鲜切莲藕片褐变和活性氧代谢的影响

徐雨晗，包垠秋，易 阳，艾有伟，王宏勋，闵 婷*

（1 武汉轻工大学食品科学与工程学院 武汉 430023 2 武汉轻工大学生命科学与技术学院 武汉 430023）

莲藕是营养丰富的水生蔬菜，且具有一定药用价值。 近些年来，鲜切莲藕逐步走向市场，受到广大消费者的喜爱。有研究表明，酶促褐变是导致鲜切莲藕片货架期质量下降的主要因素，其主要反应是多酚向醌类物质的转化[1]。 也有研究表明，活性氧代谢与褐变密切相关，提高鲜切莲藕的抗氧化能力，能延缓褐变的发生[2]。 目前化学处理在鲜切莲藕保鲜中的应用最为广泛，如H2S[2]、草酸[3]、ClO2[4]及表油菜素内酯[5]处理均能有效延缓鲜切莲藕的褐变，然而，化学试剂的安全性问题须引起足够的重视。

乙醇处理作为一种安全无毒、 化学污染小的保鲜技术，可以调节果蔬生理代谢速度[6]，减少果蔬微生物的生长和营养物质消耗，保持高质量的果蔬品质。 同时，乙醇处理能够抑制果蔬的褐变，包括莴苣[7]、鲜切甘蔗[8]、鲜切山药[9]、双孢蘑菇[10]等。 此外，乙醇处理能够提高果蔬的抗氧化能力，在木薯[11]、樱桃番茄[12]、杨梅[13]、西兰花[14]的 研究中都得到证实。目前，关于乙醇处理鲜切莲藕的报道较少。Gao 等[15]研究表明鲜切莲藕采用乙醇和抗坏血酸溶液单独处理或联合处理，能够保持鲜切莲藕的品质，延缓褐变，抑制微生物生长。然而，目前缺乏乙醇处理抑制鲜切莲藕褐变的机制研究。 本试验以莲藕为材料，研究10 ℃贮藏条件下150 μL/L 乙醇熏蒸处理2 h 对鲜切莲藕褐变的影响，并以酚类代谢和活性氧代谢为切入点，探讨外源乙醇处理延缓鲜切莲藕褐变的作用机理，以期为鲜切莲藕的货架保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试‘鄂莲5 号’莲藕，武汉市汉口北四季青农贸城。

乙醇 （分析纯级）、 福林酚、 无水碳酸钠、NaH2PO4、Na2HPO4、没食子酸、邻苯二酚、愈创木酚、H2O2、PEG 6000、PVPP、95%乙 醇、NaCl、2-硫代巴比妥酸、氯化羟胺、抗坏血酸、草酸，国药集团化学试剂有限公司；三氯乙酸，上海凛恩科技发展有限公司；2，6-二氯靛酚钠盐，源叶生物科技有限公司；Trition X-100，白鲨生物科技有限公司；苯丙氨酸解氨酶（PAL）试剂盒、过氧化氢含量测定试剂盒、过氧化氢酶（CAT）活性测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定试剂盒、羟基自由基产生速率测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；其它所用试剂均为分析纯级。

1.2 设备与仪器

JZ-300 通用色差计，深圳市金淮仪器设备有限公司；MIR-154 型低温贮藏箱，日本三洋电机株式会社；EOS 550D 相机，佳能（中国）有限公司；塑料薄膜封口机，温州市兴业机械设备有限公司；切菜机CHD-40，济南宏泰食品机械有限公司；XZ-10DTD 超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；V-1100D 型可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 乙醇熏蒸最佳时间和浓度的筛选试验 将‘鄂莲5 号’莲藕在4 ℃的冰箱中预冷24 h，剔除有病害虫害和机械损伤严重的莲藕；选择短、粗、大小均一，色泽一致的莲藕作为试验材料。用清水洗去莲藕表面污泥，去皮后，将其切成约4 mm 厚度的藕片。将切好的藕片置于清水中，在水中通臭氧5 min，以进行减菌处理。 将减菌处理后的莲藕片分成乙醇熏蒸组和对照组（CK）。 乙醇熏蒸组：将藕片从清水中捞出，甩干表面水分，平铺在塑料货架（370 mm×350 mm×60 mm）上，将铺好藕片的货架放入熏蒸装置上层（装置体积为56 L）。 在装置下层放置一块滴有一定浓度酒精的纱布，打开装置内的电风扇后，在装置表面覆上3 层保鲜膜，将盖好盖子的熏蒸装置在10 ℃冰箱放置2 h。 熏蒸完成后，将鲜切莲藕用PE 包装袋包装，于10℃冰箱中贮藏14 d。 对照组：熏蒸装置中不滴入酒精，不开启电扇，其它操作与乙醇熏蒸组相同。

在乙醇熏蒸浓度筛选预试验中，分别选用了100，150，200，250，300 μL/L 的乙醇熏蒸处理鲜切莲藕片2 h，发现150 μL/L 的乙醇熏蒸处理，莲藕的褐变程度最轻，L*值最高，因此150 μL/L 为最佳熏蒸浓度。在乙醇熏蒸时间筛选的预试验中，使150 μL/L 乙醇熏蒸处理藕片的时间分别为0.5，1，2，3，4 h，根据外观品质和L*值的变化，150 μL/L 乙醇熏蒸处理2 h 的鲜切莲藕片有最佳的外观和最高的L*值，因此选用150 μL/L 乙醇熏蒸处理鲜切莲藕2 h 进行后续试验，对照组和乙醇熏蒸处理组各项指标分别在0，2，4，6，8，10，12 d 测定。

1.3.2 乙醇熏蒸处理对鲜切莲藕褐变的影响试验感官品质采用佳能EOS 550D 相机在小型摄影棚中拍摄。表面色差的变化采用JZ-300 通用色差计测量，记录L*值，每个样品重复3 次。 褐变度测定方法参照Min 等[1]方法。 取3.0 g 莲藕组织样品于30 mL 蒸馏水中，在冰浴条件下匀浆，在4 ℃下以10 000 r/min 离心10 min，取上清液在25 ℃下保温5 min，在410 nm 波长下测定吸光度，褐变度表示为OD410nm×10，每个样品重复3 次。

1.3.3 乙醇熏蒸处理对鲜切莲藕酚类代谢的影响试验 总酚含量根据Folin-Ciocalteu 方法测定[1]，结果表示为没食子酸当量mg/kg FW。每个样品重复3 次。 总醌含量测定参考Yan 等[7]的方法，将5.0 g 鲜切莲藕组织于50 mL 离心管中，加入20 mL 甲醇，以10 000 r/min 匀浆1.2 min，匀浆完毕后以10 000 r/min 在4 ℃离心10 min，取上清液在437 nm 波长处测定其吸光度，可溶性醌表示为OD437nm。 每个样品重复3 次。

使用苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine enzyme，PAL）测试盒测定鲜切莲藕中PAL 活力。一个PAL活力单位定义为每g 组织在每mL 反应体系中使290 nm 波长处吸光度值变化0.1 所需的酶量。 每个样品重复3 次。使用Min 等[1]的方法测定多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活性。 一个PPO 酶活力单位定义为每min 引起吸光度改变0.001 所需酶量。 每个样品重复3 次。

1.3.4 乙醇熏蒸处理对鲜切莲藕ROS 代谢的影响试验 超氧阴离子自由基产生速率使用盐酸羟胺法[16]测定。 超氧阴离子自由基产生速率定义为每min 每g 果蔬组织产生的超氧阴离子的物质的量，表示为nmol/（min·g），每个样品重复3 次。 羟自由基生成速率和过氧化氢含量分别使用羟基自由基测定试剂盒和过氧化氢含量测定试剂盒测定，每个样品重复3 次。

分别使用总超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒和过氧化氢酶（Catalase，CAT）测定试剂盒测定鲜切莲藕中SOD 和CAT 酶活力。 一个SOD 活力单位定义为在1 mL 反应溶液中每g 组织的SOD 抑制率达到50%，一个CAT活力单位定义为每g 组织每s 分解1 μmol 过氧化氢。 每个样品重复3 次。 使用Min 等[1]方法测定过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性。 一个POD 酶活力单位定义为每min 引起吸光度变化0.01 所需的酶量。 每个样品重复3 次。

抗坏血酸含量的测定采用2，6-二氯酚靛酚滴定法[16]，每个样品重复3 次。 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-Diphenyl -2 -trinitrophenylhydrazine，DPPH） 自由基清除率的测定参考Yi 等[17]的方法，每个样品重复3 次。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 乙醇熏蒸处理对鲜切莲藕褐变的影响

鲜切果蔬的褐变程度会影响消费者的购买欲望，乙醇熏蒸处理后鲜切莲藕的褐变程度变轻。由图1a 可知，在贮藏处理前期，鲜切莲藕的外表颜色为亮白色，经过12 d 贮藏，对照组的鲜切莲藕表面呈棕褐色，处理组的鲜切莲藕呈浅棕色。 如图1b～1c 所示，在贮藏过程中，鲜切莲藕的褐变度不断上升，L*值不断下降，乙醇处理显著延缓了鲜切莲藕褐变度的上升和L*值的下降（P<0.05）。 经过12 d 贮藏，处理组的褐变度比对照组低6%，L*值比对照组高19%。

图1 乙醇熏蒸处理对鲜切莲藕片褐变的影响Fig.1 Effects of ethanol vapor treatment on browning of fresh-cut lotus root slices

2.2 乙醇熏蒸处理对鲜切莲藕酚类代谢的影响

2.2.1 对总酚和总醌含量的影响 酚类物质向醌类物质的转换是果蔬酶促褐变的重要反应，总酚含量的降低有利于延缓褐变的发生[18]。如图2a～2b所示，鲜切莲藕在贮藏12 d 内，乙醇处理显著抑制了鲜切莲藕中总酚和总醌含量的上升 （P<0.05），贮藏至第12 天时，对照组的总酚和总醌含量分别是对照的1.24 和1.18 倍。

图2 乙醇熏蒸处理对鲜切莲藕片总酚和可溶性醌含量的影响Fig.2 Effects of ethanol vapor treatment on the contents of total phenol （a） and soluble quinone （b）of fresh-cut lotus root slices

2.2.2 对PAL 和PPO 活力的影响 PAL 酶是酚类物质合成途径——苯丙烷代谢的限速酶[7]，在有氧环境下PPO 能促进多酚向醌的转化。 如图3a～3b 所示，在整个贮藏期间，乙醇熏蒸处理显著抑制了鲜切莲藕PAL 和PPO 活力的上升（P<0.05），第12 天时，处理组PAL 和PPO 酶活力分别比对照组低约10%和30%。

图3 乙醇熏蒸处理对鲜切莲藕片PAL 和PPO 活力的影响Fig.3 Effects of ethanol vapor treatment on the activities of PAL （a） and PPO （b） of fresh-cut lotus root slices

2.3 乙醇熏蒸处理对鲜切莲藕活性氧代谢的影响

2.3.1 对ROS 生成的影响 通过呼吸作用进入生物体内的氧分子，接受1 个电子后变成O2-·，O2-·能衍生成H2O2、·OH 和1O2等自由基；·OH 和H2O2的积累可引发细胞质膜上不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应，产生活性氧自由基，对机体产生伤害，从而导致果蔬品质下降[16]。 由图4a 可知，贮藏期间鲜切莲藕的O2-·生成速率先略下降，然后在第4 天上升至峰值，最后持续降低，乙醇处理显著抑制了低温贮藏期间鲜切莲藕的O2-·生成速率（P<0.05）。 由图4b～4c 可知，贮藏期间鲜切莲藕的·OH 产生速率和H2O2均呈先上升后下降的趋势，乙醇处理显著抑制了H2O2的积累（P<0.05），同时降低了·OH 产生速率，然而与对照之间差异不显著（P>0.05）。

图4 乙醇熏蒸处理对鲜切莲藕片ROS 积累的影响Fig.4 Effects of ethanol vapor treatment on the ROS accumulation of fresh-cut lotus root slices

2.3.2 对抗氧化酶活力的影响 SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2-·），并与CAT、POD 等酶共同抵御活性氧或其它过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害[16]。 如图5a 所示，在贮藏期间，处理组和对照组的SOD 活力较第0 天都有所提高，且处理组的SOD 活力高于对照组，在贮藏12 d 时，处理组的SOD 活力是对照组的1.02 倍。由图5b 可知，在贮藏过程中，CAT 活力呈先上升后降低的趋势，处理组的CAT 活力显著高于对照组（P<0.05）。 如图5c 所示，在2～8 d，处理组的POD 活力显著高于对照组（P<0.05）。 在贮藏末期，乙醇熏蒸对POD 酶活力的提高作用消失，甚至对照组酶活力高于处理组。

图5 乙醇熏蒸处理对鲜切莲藕片SOD、CAT和POD 活力的影响Fig.5 Effects of ethanol vapor treatment on the activities of SOD （a），CAT （b），and POD activity （c）of fresh-cut lotus root slices

2.3.3 对非酶促抗氧化能力的影响 抗坏血酸含量和DPPH 自由基清除能力是评价果蔬贮藏品质非酶促抗氧化能力的重要指标[18]，由图6a 可知，在整个贮藏过程中，鲜切莲藕的抗坏血酸含量持续下降，乙醇熏蒸处理显著抑制了抗坏血酸的损失（P<0.05），贮藏至12 d，CK 组的抗坏血酸含量下降约41%，乙醇熏蒸组下降约34%。 由图6b 可知，DPPH 自由基清除率先上升后下降，贮藏期间处理组中DPPH 自由基清除率较对照组有所提高，而两者之间差异不显著（P>0.05）。 两组鲜切莲藕片的DPPH 自由基清除率均在第4 天左右出现峰值，在该天处理组的DPPH 自由基清除率是对照组的1.08 倍。

图6 乙醇熏蒸处理对鲜切莲藕片抗坏血酸含量和DPPH 自由基清除率的影响Fig.6 Effects of ethanol vapor treatment on the ascorbic acid contents and DPPH free radical scavenging capacity of fresh-cut lotus root slices

3 结论与讨论

鲜切莲藕加工过程中要经过去皮、 切分和包装等一系列加工程序，这些工序加快了鲜切莲藕的褐变。本研究采用乙醇熏蒸处理鲜切莲藕，发现150 μL/L 乙醇熏蒸处理能有效维持鲜切莲藕的外观品质和L*值，显著降低表面褐变程度。 在其它果蔬中也有类似的发现，200 μL/L 乙醇熏蒸处理鲜切山药[9]，400 μL/L 乙醇熏蒸处理双孢蘑菇[10]和200 mL/L 乙醇浸泡处理鲜切莴苣[7]能降低果蔬表面褐变程度，然而不同品种的果蔬乙醇处理浓度和处理方式存在差异。

大量研究证实，鲜切莲藕褐变主要是由酶促褐变引起，酚类代谢是酶促褐变的重要途径。 PAL酶是酚类物质形成的关键酶，乙醇熏蒸处理显著抑制了鲜切莲藕PAL 酶活力。 PAL 酶活力的降低有助于延缓褐变[19]，Yan 等[7]在鲜切生菜的研究中也有类似发现，且该研究认为乙醇处理对PAL 酶活力的抑制作用与PAL 相关酶基因的表达下调相关。 与PAL 酶活力降低相对应，乙醇熏蒸处理后鲜切莲藕中总酚含量显著降低，与前人在鲜切莴苣[7]和双孢蘑菇[20]中的报道结果一致。 PPO 能够催化酚类物氧化形成醌类物质，乙醇处理显著降低了鲜切莲藕中的PPO 活力。彭益强等[21]提出，乙醇分子中羟基和邻苯二酚等酚类化合物化学性质较为相似，其可通过与PPO 的底物竞争酶活性中心基团的方式抑制PPO 酶活力。 鲜切莲藕贮藏过程中，醌类物质的大量积累导致黑色素的形成，乙醇熏蒸能够抑制醌类物质的积累，从而减轻褐变。这不仅与外观上深褐色变浅相对应，还与总酚含量降低和PAL 和PPO 酶活力的降低相对应。 因此，乙醇处理能够通过抑制鲜切莲藕在贮藏过程中的酚类代谢，从而减轻褐变。

ROS 有多种形式，超氧阴离子自由基（O2-·）、羟基自由基（·OH）和过氧化氢（H2O2）等均为常见的ROS[22]。 本研究中，乙醇处理能够减少细胞内H2O2含量的积累，降低O2-·产生速率及·OH 生成能力，通过降低活性氧代谢产物的生成速率，减轻活性氧对细胞造成的伤害。 Liu 等[11]研究发现，乙醇处理可有效降低木薯的H2O2含量及O2-·生成速率，与本研究结果一致。抗氧化酶在褐变抑制中起着关键作用，SOD、CAT 和POD 等作为酶促防御系统中主要的代谢酶，能清除自由基，减轻膜的过氧化，维持膜的稳定性[23]。 在本研究中，乙醇熏蒸处理后的鲜切莲藕片中有SOD、CAT 和POD 同步激活的现象，这与乙醇处理后鲜切莲藕具有更好的外观相一致。这些结果表明，乙醇诱导的抗氧化酶活力提升可能是莲藕片褐变抑制的关键条件。在乙醇熏蒸处理鲜切西兰花[24]和鲜切草莓[25]中也发现了乙醇处理对植物酶促抗氧化系统的促进作用。 Han 等[24]研究发现乙醇熏蒸能提高鲜切西蓝花的SOD、CAT 和POD 酶活力以延缓其衰老，Li 等[25]的研究表明乙醇熏蒸通过上调抗氧化酶基因来诱导酶活力的提升。此外，乙醇熏蒸也能提高鲜切莲藕的非酶促抗氧化能力，主要体现在显著抑制抗坏血酸含量的损失和显著提升DPPH 自由基清除能力两个方面，与前人在樱桃番茄[12]、杨梅[13]和西兰花[14]中获得的结果相似。

综上所述，150 μL/L 乙醇熏蒸处理鲜切莲藕2 h 能有效延缓贮藏期间鲜切莲藕褐变的发生，其不仅能够维持鲜切莲藕的感官品质，还能显著延缓鲜切莲藕的褐变度的上升和L*值的下降。 进一步研究表明，乙醇熏蒸处理抑制了鲜切莲藕的酚类代谢，表现为显著降低总酚和可溶性醌含量，显著抑制PAL 和PPO 酶活力。 同时，乙醇熏蒸处理提高了鲜切莲藕的抗氧化水平，其不仅显著降低了O2-·生成速率和H2O2含量，还能显著提高CAT、POD 活力和抗坏血酸含量。 此外，乙醇处理对抑制·OH 的生成速率，提高SOD 活力和DPPH自由基清除率有一定积极作用，然而与对照之间差异不显著。以上结果表明，乙醇熏蒸处理能够通过抑制鲜切莲藕的酚类代谢，提高抗氧化水平，有效减轻鲜切莲藕褐变。