增强型脂质去除固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定贝类中42种除草剂残留

朱富强，郭宇鹏，潘 军，韩岩君，吴 涛

（1 滨州市检验检测中心 山东滨州 256600 2 滨州学院生物与环境工程学院 山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心 山东滨州 256600）

除草剂对于农产品的增产、 增收发挥着重要作用。 然而，不合理施用和滥用除草剂，易使其通过渗透或地表径流进入河口和浅海生态系统，造成近岸海域除草剂残留污染[1]。 近年来，我国近岸海域表层海水中屡次检出除草剂残留[2-3]，有研究表明，某些三嗪类及酰胺类除草剂在海水中相比于河水中更难降解[4-5]，贝类主要栖息于近岸海域及潮间带，生长位置较为固定，极易富集农药残留等污染物[6-7]，最终通过食物链转移至人体内，长期食用会对人类健康造成影响。 建立贝类中多种除草剂残留的检测方法，对于准确评估贝类的食用安全风险，保障人体健康具有重要意义。

目前，贝类中农药残留的检测方法主要有液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[8]、 气相色谱法（GC）[9]、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）[10]及气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）[11]等，其中，LCMS/MS 具有灵敏度高，抗干扰能力强，重现性好，无需衍生等优点。贝类中蛋白质和脂肪含量丰富，基质复杂，对其进行测定前需进行净化处理。凝胶渗透色谱法（GPC）[12]、QuEChERS 法[13]、固相萃取法（SPE）[14]是常用的净化方法。 GPC 法除脂效果好，而操作繁琐复杂，不适用于大批量样品检测。QuEChERS 净化法主要利用石墨化碳黑（GCB）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18） 及N-丙基乙二胺（PSA）等对干扰组分实现高效快速净化，然而，对于理化性质各异的多组分农药，在净化过程中可能会导致部分农药损失，影响定量结果的准确性。传统的SPE 处理方法操作复杂，影响结果稳定性和检验效率，不能满足高通量样品快速检测要求。

增强型脂质去除 （Enhanced matrix removal，EMR-Lipid）是一种新型的高聚物吸附剂，可通过疏水相互作用和体积排阻作用的结合高效吸附脂类等杂质。 增强型脂质去除（Captiva EMR-Lipid）固相萃取柱是在EMR-Lipid 基础上升级而成，以固相萃取方式，可实现通过式一步净化，与传统的SPE 法相比，无需活化、淋洗、洗脱等操作，更为高效快速。对于脂类含量较高的样品，增强型脂质去除固相萃取法具有良好的净化效果[15-16]，而该法用于水产品中除草剂等农药残留检测前处理的研究鲜见报道。 本文采用增强型脂质去除固相萃取法净化样品，结合超高效液相色谱-串联质谱法，高效准确测定了贝类中42 种除草剂残留。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈（色谱纯），美国Tedia 公司；甲酸（纯度＞99%），美国ACS 恩科化学；萃取盐包（内含1.0 g 无水柠檬酸钠、0.5 g 柠檬酸二钠盐水合物、4.0 g 无水硫酸镁、1.0 g 氯化钠）、Captiva EMRLipid 固相萃取柱 （3 mL/300 mg）、EMR-Lipid 净化管、EMR-Lipid Polish 萃取管，美国Agilent 公司；PSA、GCB，天津博纳艾杰尔科技有限公司。

标准样品：胺苯磺隆、环丙嘧磺隆质量浓度均为100 μg/mL，BePure 公司； 苯磺隆质量浓度为100 μg/mL，农业农村部环境保护科研监测所；其余39 种标准样品质量浓度均为100 μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司。

贝类样品，本地批发市场及网购。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色谱仪、Xevo TQ-XS 串联质谱仪，美国沃特世公司；Shim-pack GIST C18-AQ 色谱柱 （100 mm × 2.1 mm，1.9 μm），岛津（上海）实验器材有限公司；3-18K5 离心机，德国SIGMA 公司；CP225D 电子分析天平，德国Sartorius 公司；Milli-Q Advantage A10 超纯水仪，美国Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制 各准确移取42 种农药标准溶液100 μL，置于同一10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到混合标准储备液，质量浓度为1.00 μg/mL。 临用前以空白基质提取液进行稀释。

1.3.2 样品前处理 提取：称取均质样品5 g（精确至0.01 g），置于50 mL 聚丙烯离心管中，加入3 mL 纯水，充分混合，涡旋振荡1 min，加入10.0 mL 乙腈，充分混合，涡旋振荡5 min，再加入萃取盐包，充分混合，涡旋振荡1 min 后，以6 000 r/min离心5 min 后取上清液，待净化。

QuEChERS 净化[17]：准确移取1 mL 上清液，置于装有50 mg PSA 和20 mg GCB 的离心管中，涡旋振荡1 min 后，以6 000 r/min 离心5 min，上清液经0.22 μm 尼龙针头式过滤器过滤，待测。

EMR-Lipid 净化： 准确移取5 mL 上清液，提取液至EMR-Lipid 净化管中 （提前用5 mL 纯水充分润湿活化），涡旋振荡2 min，于6 000 r/min 离心5 min，将上清液转移至EMR-Polish 管中，剧烈振荡1 min 进行盐析后以6 000 r/min 离心5 min，上清液经0.22 μm 尼龙针头式过滤器过滤，待测。

Captiva EMR-Lipid 净化： 准确移取2.4 mL上清液与0.6 mL 纯水混合，通过Captiva EMRLipid 固相萃取柱，重力作用下收集滤液，经0.22 μm 尼龙针头式过滤器过滤，待测。

1.3.3 色谱条件 Shim-pack GIST C18-AQ 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相：0.1%甲酸溶液（A 相）、乙腈（B 相）。 流速：0.3 mL/min，柱温：40 ℃，进样体积：2 μL。 梯度洗脱程序：0～1.5 min，10%B；1.5～15.0 min，10%B～95%B；15.0～17.5 min，95%B；17.5～18.0 min，95%B～10%B；18.0～20.0 min，10%B。

1.3.4 质谱条件 离子源： 电喷雾电离源（ESI）；检测模式：多反应监测（MRM）；扫描方式：正离子模式；毛细管电压：2.00 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气流量：1 000 L/h； 脱溶剂气温度：500 ℃；碰撞气流速：0.15 mL/min； 锥孔反吹气流量：150 L/h；锥孔电压：均为10 V。 42 种目标化合物的质谱分析参数及保留时间见表1。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的选择

2.1.1 质谱条件的选择 以流动注射方式，在电喷雾电离模式下，比较正负离子模式下的42 种目标物标准溶液（100 ng/L）质谱信号，发现在正离子模式下的各目标物正离子信号普遍比负离子模式强，故选用正离子模式。 分别对质量浓度为100 μg/L 的各目标化合物单标准溶液进行一级质谱扫描，确定分子离子，然后以分子离子为母离子，进行二级质谱扫描，筛选碎片离子，选取响应值高、干扰少的2 个子离子作为特征子离子，其中以响应值高的子离子作为定量离子。 在多反应监测模式下，确定最优质谱参数，使各目标化合物质谱响应信号达到最佳。 各目标化合物质谱参数见表1。

表1 42 种目标化合物的质谱分析参数Table 1 Mass spectrometry parameters of 42 analytes

2.1.2 色谱条件的选择 选择Shim-pack GIST C18-AQ 分析柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）进行色谱分离，由于酸性环境下有利于正离子电离，故以0.1%甲酸水溶液为流动相A 相，并考察甲醇、0.1%甲酸甲醇、乙腈、0.1%甲酸乙腈作为流动相B相时，对质谱信号及分离的影响。 结果发现，采用甲醇时，42 种目标化合物峰响应值整体较低，且特丁通峰型分叉；采用0.1%甲酸甲醇时，峰响应值略有提高，特丁通峰型正常。 采用乙腈时，与甲醇及0.1%甲酸甲醇相比，峰保留时间略有提前，而峰响应值更高，各目标化合物峰型尖锐；采用0.1%甲酸乙腈时，峰响应值、峰保留时间及峰型较乙腈差别较小，故最终采用0.1%甲酸水溶液-乙腈作为流动相。 图1 为空白菲律宾蛤仔基质溶液中加标42 种目标化合物的总离子流色谱图。

图1 菲律宾蛤仔样品中添加42 种目标化合物（添加水平为5 μg/kg）的总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms of the 42 analytes in Ruditapes philippinarum sample（5 μg/kg for each analyte）

2.2 前处理条件的选择

乙腈是农药残留分析中常用提取液[18-19]，对于动物源性样品的提取，相比较丙酮、正己烷等提取液，乙腈具有良好的沉降蛋白效果，且萃取出的脂类杂质较少[20]，并有利于后续样品净化。 在空白菲律宾蛤仔中添加质量浓度为5 μg/kg 的目标化合物，考察乙腈、0.1%乙酸乙腈、1%乙酸乙腈的提取效率，结果表明，采用乙腈、0.1%乙酸乙腈及1%乙酸乙腈时，提取效率差异较小，均可满足要求，综合考虑成本及环保，选用乙腈作为提取溶剂。

贝类等动物源性样品中含有大量脂肪及磷脂类、蛋白质等干扰基质，会对检测结果及仪器性能带来影响，需要对样品提取液进行净化。在空白菲律宾蛤仔基质样品加标量为5 μg/kg 时，考察了QuEChERS、EMR-Lipid 分散固相萃取、Captiva EMR-Lipid 固相萃取3 种净化方式的效果，结果表明，按照文献[17]所报道的QuEChERS 法，采用PSA 及GCB 作为净化材料，所得净化液澄清透明（见图2），这是因为GCB 对色素具有良好的吸附效果，然而15 种磺酰脲类除草剂平均回收率小于20%（见图3），主要原因可能是由于PSA 含碱性基团，磺酰脲类除草剂显弱酸性，两者发生吸附[21]，导致回收率降低。 采用EMR-Lipid 分散固相萃取、Captiva EMR-Lipid 固相萃取净化时，效果比较理想，42 种目标化合物平均回收率均在90%～110%之间，见图3。 与EMR-Lipid 净化方法相比，因Captiva EMR-Lipid 净化方法更为便捷高效，且通过对比净化后所得样品，发现经Captiva EMR-Lipid 净化，样品溶液更为澄清透明 （见图2），故选用Captiva EMR-Lipid 固相萃取净化方式。

图2 经不同净化方式处理后菲律宾蛤仔提取液照片Fig.2 Graphs of the Ruditapes philippinarum extracts cleaned up by different purification methods

图3 3 种净化方法的回收率比较Fig.3 Comparison among recoveries of 3 purification methods

2.3 进样体积的选择

净化后所得滤液的溶剂为80%乙腈，其洗脱强度强于初始流动相的洗脱强度，易导致溶剂效应，致使柱效降低，峰型变差。 稀释样品或减少进样量可降低溶剂效应的影响，为简化操作步骤，避免稀释对方法检出限的影响，本文采用减小进样量的方法降低溶剂效应的影响，经试验发现，当进样量为5 μL 时，50%以上目标化合物峰型较差，当进样量为2 μL 时，各目标化合物峰型均正常，故最终将进样量确定为2 μL。

2.4 基质效应的考察

在电喷雾电离模式下，基质成分和目标化合物在离子化时，会相互竞争，产生基质效应。 基质效应会对定性、定量结果造成影响。基质效应计算公式为：基质效应（ME）=（空白基质配制校准曲线斜率/空白溶剂配制校准曲线斜率-1）×100%[22]。当|ME|＜20%时，表明为弱基质效应；当20%≤|ME|≤50%时，表明为中等程度基质效应；当|ME|＞50%时，表明为强基质效应。 考察了目标化合物在菲律宾蛤仔中的基质效应，结果见图4。结果表明，未净化时有5 种目标化合物为强基质效应，占比11.9%，14 种目标化合物为中等程度基质效应，占比33.3%；经Captiva EMR-Lipid 净化后，仅有5 种目标化合物（苯噻酰草胺、胺苯磺隆、醚磺隆、玉嘧磺隆、磺酰磺隆）表现为中等程度基质效应（占比11.9%），其余37 种目标化合物均表现为弱基质效应，这表明Captiva EMR-Lipid 净化效果显著，有效降低了基质影响。本文采用空白基质匹配外标校正进行定量分析，可进一步降低基质效应影响。

图4 菲律宾蛤仔基质溶液中目标化合物的基质效应强度等级分布比率Fig.4 Ratio distribution of different matrix effect strength levels of analytes in the matrix of Ruditapes philippinarum

2.5 线性关系、检出限及定量限

以空白菲律宾蛤仔样品提取溶液配制42 种目标化合物系列标准溶液，采用所建立的方法进行测定，以定量离子峰面积（Y）对应质量浓度（X）进行线性回归。 以信噪比S/N=3 确定方法的检出限，以S/N=10 确定方法的定量限。 结果见表2，在0.2～20 μg/L 范围内，42 种目标化合物线性关系良好，相关系数（R2）均大于0.992。 42 种目标化合物的方法检出限为0.2～0.4 μg/kg，方法定量限为0.5～1.0 μg/kg。

表2 42 种目标化合物在空白菲律宾蛤仔基质中线性关系、方法检出限、定量限Table 2 Correlation equations，limits of detection （LODs） and limits of quantification （LOQs） of 42 analytes in the matrix of Ruditapes philippinarum

（续表2）

2.6 回收率与精密度

应用所建立的方法，以空白菲律宾蛤仔样品为验证基质，分别添加1 倍LOQ、2 倍LOQ、10 倍LOQ 的目标化合物混合标准溶液，每个加标水平重复6 次，计算加标回收率及相对标准偏差。回收率及相对标准偏差结果见表3，42 种目标化合物在实际空白菲律宾蛤仔样品中的3 个加标水平的平均回收率为61.0%～110.3%，相对标准偏差为0.1%～17.4%。

表3 42 种目标化合物在空白菲律宾蛤仔基质中加标回收率及相对标准偏差Table 3 Average spiked recoveries，and relative standard deviations （RSDs） of 42 analytes in the matrix of Ruditapes philippinarum

（续表3）

2.7 实际样品的测定

采用本方法对2021年6月份购自本地批发市场及网购的23 批次样品（菲律宾蛤仔5 批次、文蛤4 批次、栉孔扇贝4 批次、四角蛤蜊3 批次、长牡蛎3 批次、毛蚶2 批次和紫贻贝2 批次）进行检测，结果发现，1 批次菲律宾蛤仔、3 批次文蛤、2批次长牡蛎中检出除草剂残留，栉孔扇贝、四角蛤蜊、毛蚶及紫贻贝中均未检出除草剂残留。阳性样品检出结果见表4。 长牡蛎和文蛤中除草剂检出率较高，且存在多种除草剂复合污染的情况，这与文献[23]报道相符。

表4 样品分析结果Table 4 Analytical results of samples

现行国家标准《食品中农药最大残留限量》[24]尚未规定贝类中三嗪类、 酰胺类及磺酰脲类等除草剂残留限量值。日本《食品中残留农业化学品肯定列表制度》[25]中规定的“一律标准”限量值为0.01 mg/kg，由表4 得知，一批次文蛤中西草净及扑草净检出结果（19.2 μg/kg 和20.0 μg/kg）均已超过此限量要求，1 批次文蛤中扑草净检出结果（9.2 μg/kg）接近此限量要求，贝类中除草剂残留风险需引起重视。

3 结论

本文建立了以增强型脂质去除固相萃取柱对样品进行净化，以超高效液相色谱串联质谱法同时快速测定贝类中14 种三嗪类、13 种酰胺类及15 种磺酰脲类除草剂残留的分析方法。 研究结果表明，方法的提取净化效率快，效果好，灵敏度和准确度高，平均回收率为61.0%～110.3%，相对标准偏差为0.1%～17.4%。 可满足贝类中42 种三嗪类、酰胺类及磺酰脲类除草剂残留定性、定量分析要求，这为贝类中农药残留安全风险监控提供了新的可行途径。