影响牡丹石榴外植体褐变的因素分析

王兰明+刘艳芬+高彦魁

摘要：褐变是影响牡丹石榴离体培养成功的关键因素之一。为减轻牡丹石榴初代培养中的褐变问题，研究基本培养基类型、附加物、光照条件、继代周期、取材时间5种因素对外植体褐变的影响。结果表明：适宜的基本培养基为1/2MS；黑暗处理对褐变的影响不明显；聚乙烯吡咯烷酮对褐变有明显的抑制作用，最佳处理浓度为2.0 mg/L；4月下旬取带芽的半木质化茎段为外植体，其褐变程度最轻；取材时间和转接次数对褐变的影响明显。

关键词：牡丹石榴；聚乙烯吡咯烷酮；外植体；褐变；因素

中图分类号：S665.404+.3 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0181-03

石榴（Punica granatum）为石榴科石榴属植物，是我国重要的果树和观赏花木之一。牡丹石榴是近年来选育的新优品种，其花朵硕大似牡丹，花期长达5个月，果大味美，且花果同期同树，是花果俱佳的珍贵石榴品种[1-2]，颇具推广价值。

石榴常规的扦插、分株等繁殖方法，繁殖速度慢，难以满足日益增多的种苗需求。目前，已有学者致力于通过组织培养进行石榴快速繁殖的研究[3-5]。但是由于石榴体内酚类物质含量高，组织培养过程中外植体褐变严重[6-7]，常造成外植体死亡，成为石榴离体培养过程中的关键制约因素。目前，关于牡丹石榴离体再生技术虽然鲜有报道[8]，但没有关于其褐变这一关键问题进行报道和系统研究。本试验以牡丹石榴带芽茎段为外植体，研究基本培养基、附加物、光照条件、转接次数、取材时间5种因素对外植体褐变的影响，以探讨减轻牡丹石榴离体培养中褐变现象的因素条件，为其离体再生体系的建立和规模化繁殖提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料取自河北工程大学实验基地引进的3年生牡丹石榴树苗。

1.2 试验方法

试验于2014年4月下旬进行，以牡丹石榴半木质化茎段为外植体，经过常规消毒后，剪切成单芽茎段，接种于各处理培养基，进行单因子试验。培养基和培养条件若无特殊说明，蔗糖含量均为30 g/L，琼脂含量均为5.5 g/L，pH值5.8，培养温度25 ℃，光照时间16 h/d，光照度2 500 lx。接种1周后统计各处理的褐变率和褐变系数，5周后统计褐变死亡率、萌芽率、腋芽生长状况。

相应计算公式：外植体污染率=污染的外植体总数/接种的外植体总数×100%；褐变率=存活的褐变总数/存活的外植体总数×100%；存活率=存活的外植体总数/接种的外植体总数×100%；褐变指数=（∑褐变级数×该级个数×100）/（褐变总数×最高级级数）。褐变级数：0级，茎段基部褐色物质渗出不明显，5周后腋芽正常萌动；1级，茎段基部有少量淡褐色物质渗出，5周后腋芽正常萌动；2级，茎段基部褐色物质扩散至茎段直径的1～2倍，5周后茎芽萌动缓慢；3级，深褐色物直径扩散至茎段直径的2倍以上，茎段部分变黑褐色，腋芽不萌动；4级，茎段基部有大量褐色物质渗出，5周后腋芽、茎段变黑死亡。

1.2.1 基本培养基的确定 2014年4月中旬，将表面灭菌的外植体接种于MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS 4种含有不同浓度无机盐的基本培养基中，每种培养基均添加0.5 mg/L6-BA、0.1 mg/L IBA。每个处理接种8～10瓶，每瓶接种2个外植体。重复3次，数据用SPSS统计软件分析。

1.2.2 光照条件的确定 2014年4月中旬，将外植体表面灭菌后接种于MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培养基中，光照条件共设3个处理，分别为黑暗、光照时间16 h/d、全光照。每个处理接种12～13瓶，每瓶接种2个外植体。

1.2.3 附加物浓度的确定 2014年4月下旬，附加物聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，简称PVP）共设5个处理，每个处理接种8～10瓶，每瓶接种2个外植体，重复3次。数据用SPSS统计软件分析。各处理配方：处理1，1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA；处理2，1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+1.0 g/L PVP；处理3，1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+2.0 g/L PVP；处理4，1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+3.0 g/L PVP；处理5，外植体用含4.0 mg/L PVP无菌溶液浸泡5 min后接入处理1培养。

1.2.4 不同取材时期和转接次数的确定 分别于2014年4月下旬、5月下旬、6月下旬、7月下旬、8月下旬5个不同时期进行取材接种，将外植体表面灭菌后接种于1/2MS+0.5 mg/L6-BA+0.1 mg/L IBA+2.0 g/L PVP培养基上。每个处理接种12～13瓶，每瓶接种2个外植体。以2 d为继代周期，分别统计各取材时期不再发生褐变所需的转接次数。

2 结果与分析

2.1 基本培养基对外植体褐变的影响

由表1可见，在MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS 4种基本培养基上，褐变发生率均为100.0%，但褐变指数、褐变死亡率以及萌芽率、腋芽生长状态不尽相同；MS培养基与1/2MS、1/3MS、1/4MS培养基的褐变指数、褐变死亡率和萌芽率均有显著差异，说明无机盐含量对褐变程度有明显影响；虽然MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS培养基的褐变程度呈逐渐减轻的趋势，但是接种5周后，1/3MS、1/4MS培养基上的新叶较小，可能是无机盐含量低造成的。因此，选择1/2MS作为基本培养基，既可以减轻褐变程度，又不影响腋芽的生长。

2.2 光照条件对外植体褐变的影响

由表2可以看出，外植体在3种光照条件下的褐变程度均较严重，褐变率依然均为100%；虽然褐变指数有逐渐减小的趋势，但是3个处理间整体变化与褐变死亡率、萌芽率均无明显差异。结果表明，仅黑暗处理对于减轻牡丹石榴外植体褐变的效果并不明显。

2.3 附加物对外植体褐变的影响

由表3可见：添加不同浓度PVP的褐变指数、褐变死亡率均显著低于不加PVP（对照）的处理；其中2.0、3.0 mg/L PVP的处理效果最好，但是后者萌发的新芽平均长度和新叶数均低于前者；4.0 mg/L PVP溶液浸泡的褐变率与对照相同，依然为100%，虽然褐变指数、褐变死亡率、萌芽率与对照相比均差异显著，但是仍然显著高于2.0、3.0 mg/L PVP的效果。因此可见，1/2MS+0.5 mg/L 6-BA +0.1 mg/L IBA +2.0 mg/L PVP为减轻牡丹石榴外植体褐变最有效的培养方法。

2.4 不同取材时期和转接继代次数对外植体褐变的影响

取材时间对外植体的褐变率、褐变指数、褐变死亡率以及萌芽率均有明显影响，严重时甚至可导致外植体全部死亡。在生长季枝条半木质化后，取材时间越早，褐变越轻。由表4可以看出，4月下旬接种的外植体褐变指数最小，为18.8%，褐变死亡率为0，萌芽率可达89.7%；而随着取材时间的推移，褐变程度明显加重，虽然培养基中2.0 mg/L PVP为附加物，但是6月下旬开始，外植体褐变发生率已达100%；8月下旬取材时外植体的褐变死亡率已达84.7%，萌芽率为0。

转接继代对于保证外植体的成活有明显的作用。在添加2.0 mg/L PVP的培养基上，4月下旬取材时，不需要转接，外植体就能正常萌芽。5月下旬时，需要2 d后转接1次，即可抑制褐变的发生。以后需要多次转接，才能保证外植体的成活。而8月下旬取材时，褐变死亡率高达84.7%，虽然有个别外植体成活，但5周后由于褐变严重，没有萌芽。

3 结论与讨论

3.1 结论

牡丹石榴组培过程中，外植体褐变严重。本试验表明，无机盐浓度、PVP附加物对减轻褐变有明显效果，1/2MS无机盐浓度、2.0 mg/L PVP附加物可作为最适培养基成分。暗处理对褐变影响效果不明显。取材时间对外植体褐变程度影响极大，河北省中南部4月下旬为最佳的取材时期。多次转接可以起到较好的减轻褐变、保证外植体成活的效果。

3.2 讨论

植物组织培养过程中，外植体的褐变时有发生。尤其是木本植物与单宁、酚类物质含量高的植物，如板栗[9]、核桃[10]、黄连木[11]等，褐变程度尤其明显，严重时可导致外植体死亡。除外植体基因型外，褐变程度还受取材时期、外植体类型、培养基成分、培养条件等多种因素的影响。

降低无机盐浓度对于减轻褐变的发生有较好的作用。但无机盐浓度过低，随着培养时间的延长，会影响外植体的正常生长。培养基中附加不同浓度的抗氧化剂、吸附剂均能有效抑制褐变的发生，但植物材料不同，附加物种类和浓度会有差别。王菲等在三白石榴[6]、王立娅等在蝴蝶兰的研究[12]中，均认为PVP对减轻褐变有较好的效果。而有些研究认为，活性炭抑制蝴蝶兰褐变的效果优于PVP。由此可见，植物组织培养中，加入酚类物质的吸附剂PVP对于减轻外植体的褐变仍没有一定的规律，其抑制褐变的机制还须进一步研究。

一般认为，暗培养由于可以抑制光诱导的多酚氧化酶的活性，因此可以减轻褐变的发生。这在减轻蝴蝶兰的褐变程度[12]，延缓黄连木[11]、沙棘[13]的褐变时间方面均有报道。本试验发现，暗培养对褐变程度的减轻或延缓均没有明显作用，推测牡丹石榴褐变的发生过程除与多酚氧化酶相关外，可能还有不受光诱导的其他酶的参与，这一机制仍有待进一步研究。

本试验表明，取材时期对褐变程度有明显影响，褐变程度最轻的取材时期为4月下旬半木质化的枝条，这与在紫叶黄栌[14]、牡丹[15]研究中的报道一致。这可能与不同生长时期植物体内酚类物质含量不同有关。枝条生长早期，牡丹石榴体内酚类物质的含量较低，随着生长的继续，酚类物质含量逐渐增高，褐化日趋严重。

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