ICOS与4-1BB共刺激域增强CAR-T细胞在肺癌中的抗肿瘤活性①

张志东 魏海龙 林振海 陈吉柏 彭 文（儋州市人民医院胸心肿瘤外科，儋州 571700）

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占所有病例的80%［1-3］。过去十年中，驱动癌基因靶向疗法的普及彻底改变了晚期NSCLC的治疗模式，而近年免疫疗法在NSCLC治疗中取得了惊人疗效，使其备受关注［4-7］。多项具有里程碑意义的临床试验表明，抗PD-1/PD-L1疗法可显著延长患者总生存期，但总体而言，仅有约30%的NSCLC患者受益于单一抗PD-1/PD-L1疗法［8-10］。因此，为使更多人群受益，需进一步开发新的免疫疗法。

过继性嵌合抗原受体T细胞免疫疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面已显示出惊人疗效，但多种技术和生物学障碍限制了CAR修饰的T细胞治疗实体瘤［11］。CAR通常包含3个模块：细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和传递激活信号的细胞内信号域。其中一代CAR的胞内信号域通常仅由T细胞受体CD3ζ链组成，二代CAR往往额外包含来自CD28、4-1BB、OX40、CD27或ICOS共刺激蛋白的信号域。目前，含CD28或4-1BB共刺激结构域的CAR使用最为广泛［12］。是否存在新的共刺激蛋白组合可克服CAR-T细胞在实体瘤中的障碍，是研究人员关心的问题。

研究表明，ICOS共刺激信号可增强T细胞效应功能和体内持久性［13］。间皮素MSLN作为为数不多的CAR-T细胞针对实体瘤的靶标，在包括肺癌在内的多种实体瘤中高表达，因此被选为本研究靶标［14］。本研究拟将ICOS共刺激信号域整合至传统二代CAR，探究新型CAR-T细胞是否可对肺癌治疗产生积极响应，为优化CAR-T细胞在实体瘤中的抗肿瘤活性以实现肺癌患者治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌细胞A549购自中科院上海细胞库；过表达MSLN的A549细胞系（M-A549）为本实验先前保存，采用含有10%FBS的DMEM培养基于37℃、5%CO2培养；4~6周龄雌性NSG小鼠由海南医学院动物实验中心提供；Ficoll试剂购自北京索莱宝生物科技有限公司；CD3/CD28激活磁珠购自美国Invitrogen公司；polybrene购自美国Sigma公司；Anti-CD69-PE、Anti-CD8-PE、Anti-IFN-γ-BV421、Anti-PD-1-APC抗体购自美国Biolegend公司；苏木精-伊红试剂购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒感染外周血单核细胞3例健康志愿者外周血取自儋州市人民医院血液科，所有志愿者知情同意。按照制造商说明，采用Ficoll试剂从外周血中分离PBMC，并与CD3/CD28激活磁珠1∶1混合，48 h后按MOI=10加入慢病毒，同时加入6 µg/ml polybrene，30℃、1 200 g离心60 min，培养24 h后更换正常培养基。本研究所用慢病毒由上海汉恒生物科技有限公司提供（图1A）。

1.2.2 流式细胞术检测MSLN-ICOSBBz CAR-T阳性率和CD69、IFN-γ及PD-1表达 病毒感染T细胞72 h后，取3×105个T细胞，PBS清洗3次，流式细胞仪检测MSLN-ICOSBBz CAR-T或MSLN-BBz CAR-T阳性率，以未感染的T细胞为对照。共孵育实验：将1×104个M-A549细胞与2×104个效应细胞共孵育，24 h后收集上清，离心获得效应细胞，PBS清洗3次，加入5 µl Anti-CD69-PE抗体4℃避光孵育30 min，PBS清洗3次，流式细胞仪检测CD69表达。肿瘤浸润T细胞：取30 mg肿瘤组织，机械解离后采用1 mg/ml胶原酶Ⅰ37℃消化1 h，70µm滤膜过滤，加入Anti-CD8-PE和Anti-PD-1-APC抗体4℃避光孵育30 min，加入固定破膜试剂及Anti-IFN-γ-BV421 4℃避光孵育30 min，perm/wash buffer清洗3遍，流式细胞仪检测。

1.2.3 CELigence实时细胞分析系统检测靶细胞毒性 肿瘤细胞以1×104个/孔的密度接种，按效靶比1∶1加入效应细胞，记录阻抗信号50 h，间隔5 min。

1.2.4 活体成像检测小鼠肿瘤大小 动物实验经儋州市人民医院伦理委员会审核批准。将5×106个M-A549细胞皮下注射于NSG小鼠左侧腋下，10 d后将15只小鼠随机分为3组：PBS组、MSLN-ICOSBBz CAR-T组和MSLN-BBz CAR-T组，静脉注射1×107个T细胞，回输T细胞后第21天采用Xenogen IVIS成像系统采集荧光图像，解剖小鼠肿瘤，称重。

1.2.5 HE染色 将新鲜的肿瘤组织固定于4%多聚甲醛，48 h后梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片（5 µm），脱蜡水合，根据制造商说明进行HE染色，树胶封片，显微镜下观察。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0软件进行统计学处理，计量数据采用±s表示，组间样本比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSLN-ICOSBBz CAR-T获得 以4-1BB为共刺激分子的二代CAR-T细胞（MSLN-BBz CAR-T）为基础，加入ICOS共刺激域构建三代CAR-T细胞MSLNICOSBBz CAR-T，流式细胞术结果表明，MSLN-BBz CAR-T和MSLN-ICOSBBz CAR-T均构建成功，阳性率约为40%（图1B、C）。

图1 MSLN-ICOSBBz CAR-T结构Fig.1 Construction of MSLN-ICOSBBz CAR-T

2.2 MSLN-ICOSBBz CAR-T较MSLN-BBz CAR-T体外激活能力更强 效应细胞与靶细胞共孵育后，流式细胞术结果显示，MSLN-ICOSBBz CAR-T表面CD69表达较MSLN-BBz CAR-T更高，表明其激活更充分（P<0.001，图2）。

图2 MSLN-ICOSBBz CAR-T体外激活Fig.2 Activation of MSLN-ICOSBBz CAR-T in vitro

2.3 MSLN-ICOSBBz CAR-T较MSLN-BBz CAR-T体外靶细胞裂解能力更强 效靶细胞共孵育后，T细胞增殖结果显示，MSLN-ICOSBBz CAR-T共孵育组的T细胞较MSLN-BBz CAR-T共孵育组靶细胞裂解明显增加，而正常T细胞组靶细胞裂解较少（P<0.001，图3）。

图3 MSLN-ICOSBBz CAR-T体外靶细胞毒性Fig.3 Cytotoxicity of MSLN-ICOSBBz CAR-T in vitro

2.4 MSLN-ICOSBBz CAR-T较MSLN-BBz CAR-T体内抑瘤能力更强 活体成像结果显示，MSLNICOSBBz CAR-T和MSLN-BBz CAR-T均能抑制小鼠体内肺癌细胞生长，而MSLN-ICOSBBz CAR-T较MSLN-BBz CAR-T肿瘤抑制能力更强（图4A）。瘤重比较结果也显示，MSLN-ICOSBBz CAR-T治疗组较MSLN-BBz CAR-T治疗组肿瘤质量更小（P<0.01，图4B）。

图4 体内MSLN-ICOSBBz CAR-T抑瘤能力Fig.4 Tumor inhibition ability of MSLN-ICOSBBz CAR-T in vivo

2.5 肿瘤浸润的MSLN-ICOSBBz CAR-T较MSLNBBz CAR-T拥有更显著的抗肿瘤表型 回输MSLNICOSBBz CAR-T的小鼠肿瘤组织中T细胞得到了更强的抗肿瘤表型，肿瘤浸润T细胞流式检测结果显示，MSLN-ICOSBBz CAR-T较MSLN-BBz CAR-T IFN-γ表达水平更高（P<0.000 1，图5A），同时免疫检查点PD-1表达更低（P<0.001，图5B），抗肿瘤活性更强。

图5 肿瘤浸润性T细胞抗肿瘤表型Fig.5 Anti-tumor phenotype of tumor infiltrating T cells

2.6 MSLN-ICOSBBz CAR-T与MSLN-BBz CAR-T未对小鼠产生明显器官毒性 主要器官HE结果显示，MSLN-ICOSBBz CAR-T与MSLN-BBz CAR-T均未对组织造成明显损伤，表明其在体内未产生严重毒性（图6）。

图6 主要器官HE染色结果Fig.6 HE staining results of main organs

3 讨论

尽管CAR-T细胞疗法在血液系统肿瘤中取得了巨大成功，但其在实体瘤中疗效有限［15］。本研究探讨了通过优化共刺激域增强CAR-T细胞对肺癌治疗的有效性。

研究表明，ICOS共刺激信号可增强效应T细胞介导的抗肿瘤活性［16］。本研究发现，与二代CAR-T细胞相比，通过整合ICOS CAR介导的信号增加了MSLN-ICOSBBz CAR-T的激活状态。此外，当效应细胞与靶细胞共孵育时，MSLN-ICOSBBz CAR-T靶细胞裂解能力显著高于MSLN-BBz CAR-T。内源性4-1BB信号可影响记忆CD8+T细胞数量和持久性，4-1BB刺激可将T细胞从无能和疲惫状态中解救出来，且有助于T细胞长期存活［17-18］。此外，也有研究报道，ICOS可诱导Th细胞分化，刺激T细胞产生更多的效应细胞因子，从而强化机体抗肿瘤免疫功能［19］。本研究表明，三代CAR中，通过结合4-1BB和ICOS信号域可进一步提高4-1BB CAR激活信号，增强CAR-T细胞肿瘤细胞清除能力。同时体内研究表明，肿瘤浸润的MSLN-ICOSBBz CAR-T PD-1表达更低，表明ICOS也可减轻CAR-T细胞抑制状态。

BOLE-RICHARD等［20］发现，CD28置于细胞膜远端，而CD3ζ移动至膜近端位置的结构是无功能的。因此多数三代CAR将CD28放置于细胞膜近端［21］。ICOS和CD28均为CD28家族成员，具有独特且重叠的功能，可协同调节T细胞分化。研究表明，ICOS能够比CD28更有效地激活PI3K信号传导，从而导致Akt信号传导增加［22］。因此本研究将ICOS放置于膜近端，与4-1BB联合显示出协同增强的抗肿瘤效应，支持了优化CAR T细胞共刺激的重要性。

尽管本研究构建的MSLN-ICOSBBz CAR-T已展现出良好的肺癌细胞清除功能，但仍存在不足。本研究参考文献［20］选择了将ICOS置于近膜部位，但ICOS在CAR中的其他定位需在后续研究中验证。此外，本研究通过主要脏器HE染色初步评估了MSLN-ICOSBBz CAR-T的体内安全性，但更充分的毒理研究需在后续研究中进行。

总之，本研究证明：选择ICOS协同4-1BB共刺激结构域可显著提高CAR-T细胞对肺癌的抗肿瘤功能，可指导功能增强型和持久性增强型的下一代细胞疗法设计，同时为MSLN-ICOSBBz CAR-T对肺癌治疗的进一步探索提供了依据。