流式细胞术检测NK细胞的细胞毒作用的两种方法比较①

蔡思齐 邓志辉

(南方医科大学检验与生物技术学院输血医学系,广州510515)

自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK cell)是机体天然免疫系统的重要组成部分，与抗病毒免疫、移植免疫、自身免疫疾病及肿瘤免疫密切相关。在多种细胞因子(如IL-2、IL-15等)、饲养细胞(Feeder cells)的作用下，NK细胞可发生增殖和活化，分泌细胞因子和增强细胞毒功能。目前，NK细胞免疫治疗已成为细胞免疫治疗的重要方法，准确评价NK细胞的细胞毒活性，对评估病患免疫水平及细胞免疫治疗效果具有重要意义。

检测外周血或体外培养NK细胞介导的细胞毒效应，是评估NK细胞活性的主要方法，也是了解NK细胞功能最直接的方法。目前NK细胞活性检测的主要方法有：“金标准”51Cr释放法、LDH释放法、MTT法等。这些方法或存在放射性污染，或易受实验条件、操作者熟练程度干扰，重复性差；或者无法区分靶细胞和效应细胞死亡，不能很好地反映NK细胞的细胞毒功能水平。本文在已有方法的基础上，采用流式细胞术比较钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein-AM)释放法，及羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯/7-氨基-放线菌素 D(CFSE/7-AAD)双染色法检测体外培养后的NK细胞对K562细胞及白血病原始细胞的细胞毒活性，并对检测结果进行分析，为NK细胞毒活性检测提供一种较为稳定可靠、重复性好、灵敏度高的方法。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1样本来源 K562细胞株(深圳市汉科生物工程有限公司张明杰教授赠送)，白血病原始细胞留取自在深圳市血液中心进行骨髓移植HLA配型的白血病患者，NK细胞采自健康志愿献血者。按知情同意原则，所有研究对象均签署知情同意书。

1.1.2主要试剂和仪器 X-vivo15培养液(瑞士Lonza公司)，RPMI1640完全培养液(美国Gibco公司)，人外周血淋巴细胞分离液[生工生物工程(上海)股份有限公司]，抗人 CD56、CD3抗体(美国BD Pharmingen公司)，HANK细胞体外培养试剂盒(深圳汉科生物工程有限公司)，Calcein-AM(美国Thermo Fisher公司)，CFSE、7-AAD(美国BD Pharmingen公司)，恒温二氧化碳培养箱HF240(上海力申科学仪器厂)，TDL-400低速台式大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)，BD ACCURI C6流式细胞仪(美国BD Pharmingen公司)。

1.2方法

1.2.1外周血单个核细胞分离与NK细胞培养 采集7名健康志愿献血者静脉血10 ml/人份，密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)，用X-vivo15培养液重悬细胞，调整细胞密度为(1～2)×106ml-1，于37.5℃、5% CO2培养箱中平置培养13～14 d(HANK细胞体外培养试剂盒,按说明书使用)。使用抗人CD56、CD3抗体在BD ACCURI C6流式细胞仪上测定NK细胞(CD3-CD56+)含量。

1.2.2白血病原始细胞的分离与处理 4例初诊、未经治疗的白血病患者的骨髓样本，采用人外周血淋巴细胞分离液分离获得白血病原始细胞，液氮保存备用。

1.2.3两种方法检测7例NK细胞对不同靶细胞的细胞毒作用

1.2.3.1Calcein-AM释放法检测NK细胞毒作用 取培养13～14 d的NK细胞及靶细胞，洗涤去除培养液，RPMI1640培养液调整NK细胞密度，备用。

Calcein-AM标记靶细胞：取PBS以24℃、300 g离心10 min，洗涤细胞2次，调整细胞密度为1×107ml-1；加入终浓度为5 μmol/L的Calcein-AM，混匀，置于25℃、避光处孵育30 min。取出细胞，用RPMI1640完全培养液充分洗涤，并调整靶细胞密度为4×105ml-1，备用。

效-靶细胞共培养：将处理好的效应细胞与靶细胞按不同的效靶比(20∶1、10∶1)加入U形底96孔培养板中，在25℃下100 g离心1 min使细胞密切接触。5%CO237℃培养箱，共培养4 h。设置仅NK细胞或仅靶细胞孔作为阴性对照，计算自然死亡率。

Calcein-AM释放法靶细胞死亡率检测：收集96孔细胞培养板中的细胞，PBS液洗涤细胞并重悬细胞。首先根据FSC和SSC确定靶细胞群，在FL-1通道，记录共培养前后靶细胞MFI(Mean fluorescence intensity)值(MFI自发荧光、MFI标记)，再记录效靶细胞群及阴性对照在共培养后的MFI(MFI共培养、MFI对照)；计算共培养后MFI变化值占初始荧光强度的比例，再扣除自然死亡率，即为靶细胞死亡率[1]。计算公式为：靶细胞死亡率=(MFI共培养-MFI自发荧光)/(MFI标记-MFI自发)-(MFI对照-MFI自发荧光)/(MFI标记-MFI自发)。

1.2.3.2CFSE/7-AAD双染法检测NK细胞毒作用 NK细胞准备同步骤1.2.3.1。CFSE/7-AAD法标记靶细胞：用DPBS液洗涤细胞2次，调整细胞数量为1×107个/ml。加入CFSE(美国BD Pharmin-gen公司)，终浓度为2.5 μmol/L，混匀后置于37℃水浴箱中，避光孵育10 min。取出细胞，用含有10%FBS的冷 RPMI1640充分洗涤。RPMI1640完全培养液重悬细胞，调整靶细胞密度为4×105ml-1，备用。效靶细胞培养及阴性对照设置同步骤1.2.3.1。

CFSE/7-AAD法靶细胞死亡率检测：收集96孔细胞培养板中的细胞，PBS液洗涤细胞2次，重悬细胞，加入4 μl 7-AAD标记死亡细胞，混匀，室温避光孵育20～25 min。PBS液洗涤1次。根据FSC和SSC确定靶细胞群，对CFSE+细胞进行设门，分析该细胞群中 CFSE+/7-AAD+双阳性细胞所占比率即为靶细胞死亡率。计算公式：靶细胞死亡率=杀伤后靶细胞死亡率-靶细胞自然死亡率。

1.3统计学处理 采用SPSS22.0对实验结果进行独立样本t检验分析，方差不齐时使用Cochran&Cox近似t检验(t′检验)。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1NK细胞培养结果 初始培养时NK细胞占PBMC的比例仅为(11.76±3.55)%，自第5天开始增加，至培养第13天，NK细胞比例增至(83.65±3.18)%(表1)。对培养过程中的NK细胞比例变化进行线性回归分析，决定系数R2=0.928，经F检验P=0.000 5，差异具有统计学意义；回归系数b=0.644，对b进行t检验，P=0.000 5，NK细胞纯度与培养时间存在直线关系，随着培养时间的增加，其NK细胞比例随之增加。

2.2Calcein-AM及CFSE对靶细胞的标记结果 在前述工作浓度下，Calcein-AM及CFSE均能对密度为1×107ml-1的靶细胞进行有效标记，二者对靶细胞的标记率均可达99%以上。在FL-1通道上能够显著地与NK细胞的自发荧光峰进行区分(图1)。

2.3培养第13天的NK细胞对靶细胞的细胞毒活性 NK细胞对K562细胞的细胞毒活性(表2)：在对K562细胞的杀伤中，随着效靶比的增高，两种方法检出NK细胞的细胞毒活性均增高。但在效靶比20∶1时，CFSE/7-AAD法检出的靶细胞死亡率高于Calcein-AM释放法(图2)，但差异无统计学意义(P>0.05)；在效靶比10∶1时，NK的细胞毒作用减弱，CFSE/7-AAD法(图3A～C)所检测出的细胞毒性高于Calcein-AM释放法(图2A～D)，差异具有统计学意义(P<0.05)。

NK细胞对白血病原始细胞的细胞毒活性(见表2)：本文从4名白血病患者中分离的白血病原始细胞占有核细胞的比例为(91.00±1.83)%。在对白血病原始细胞的杀伤实验中，CFSE/7-AAD检出的细胞毒性显著高于Calcein-AM释放法(P<0.05)。 在对3、4号患者白血病原始细胞的实验中，NK细胞的细胞毒作用弱，Calcein-AM释放法中FL-1上MFI改变不显著，尽管能够计算靶细胞死亡率，但结果不准确、误差大(图2E～H)，而CFSE/7-AAD能够灵敏地检出较弱的细胞毒作用(图3D～F)，与Calcein-AM法比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。两种方法所检测的各组靶细胞自然死亡率差异不具有统计学意义(P=0.45，P=0.81)。

图1 靶细胞经Calcein-AM或CFSE标记前后FL-1通道上荧光强度变化及NK细胞自发荧光

表1NK细胞体外培养的纯度变化(n=7)

Tab.1PurityofNKcellsduringvitroexpansion(n=7)

Duration of NK cells vitro expansion0 d3 d5 d7 d9 d11 d13 dParameters of linear regressionbPPurity of NK cells(%,x±s)11.76±3.556.22±2.8926.05±5.5638.40±7.5761.20±10.3573.91±6.7083.65±3.180.6440.0005

Target cellsDiagnosisK562-1#ALL2#AML3#AML4#AML10∶1Calcein-AM44.29±9.189.50±3.5014.16±6.552.07±0.692.96±1.81CFSE/7-AAD55.59±5.2528.22±5.4331.67±5.015.72±1.3111.59±4.63P-value0.010.000 010.000 10.000 30.000 220∶1Calcein-AM55.40±11.4023.16±4.8122.32±5.903.44±0.954.65±2.24CFSE/7-AAD61.14±7.6633.66±3.5237.30±2.409.69±2.5514.63±4.46P-value0.200.00 10.000 040.000 10.001

图2 Calcein-AM 法释放法检测NK细胞对K562细胞和白血病原始细胞的细胞毒作用

Note：1#，2#，3#，4# represent the leukemia blast isolated from 4 different leukemic patients at diagnosis.

3 讨论

本文中，随机健康献血者外周血PBMC中NK细胞含量仅有(11.76±3.55)%。其他针对不同地区中国人群外周血NK细胞含量的研究表明，随机人群外周血PBMC中NK细胞含量仅有(7.35～15.21)%[2-4]。本文对PBMC进行扩增，可获得纯度较高的NK细胞群，既满足本实验对细胞数量的要求，也可避免大量采血，减少对患者的负担。

Calcein-AM被用于真核细胞活力测定、细胞示踪，近年有文献报道将其用于细胞毒作用检测，能够替代51Cr释放法，重复性好、操作简便且更加精确[5-7]。 Calcein-AM能够透过细胞膜，在酯酶水解作用下产生Calcein并发出荧光。由于凋亡细胞和死细胞的细胞膜被破坏，Calcein释放，细胞群荧光强度减弱，MFI减低，因而能用于细胞毒作用的检测。但Calcein-AM释放法原理与51Cr释放法相似，因此存在一些51Cr释放法的缺陷。51Cr释放法及Calcein-AM都是基于整体水平的检测，无法检出单细胞水平的杀伤。并且二者标记细胞都依赖于细胞质的作用，难以标记一些细胞质含量少的细胞，如Daudi细胞和Raji细胞，且从细胞死亡至标记物从释放有时间差[8]。前述因素导致了51Cr释放法及Calcein-AM的适用范围受到限制、灵敏度降低。

CFSE广泛地用于细胞示踪和细胞增殖研究，同时也用于细胞毒活性的测定[9-11]。CFSE能够穿过完整的细胞膜，在胞内产生羧基荧光素分子，发出荧光。因此CFSE能够非特异性地标记整群活细胞，不需要依赖特异性抗原-抗体反应，适用的靶细胞范围广，且在细胞中荧光维持时间长、不易衰减。7-AAD是一种核酸染料，正常情况下，它不能通过正常细胞膜。随着细胞凋亡、死亡，细胞膜对7-AAD的通透性逐渐增加，使之结合细胞凋亡中的DNA，在合适波长激发光的激发下发出明亮的红色荧光。且7-AAD具有发射波谱较窄，对其他检测通道的干扰小的特点，适于多色荧光分析。CFSE及7-AAD二者联合使用，能够在单细胞水平上检测效应细胞的死亡率，实验灵敏度高，稳定性好。

在两种方法对靶细胞标记上，Calcein-AM及CFSE均能非特异性地快速标记靶细胞，对靶细胞的标记率高，荧光强度强，在FL-1通道上能显著地与效应细胞区分。在检出NK细胞对不同靶细胞的细胞毒作用实验中，靶细胞死亡率随着效靶比的增加而升高。但CFSE法检出在不同效靶比、不同靶细胞的死亡率高于Calcein-AM释放法。

在对K562细胞的实验中，20∶1的效靶比下，Calcein-AM与CFSE法检出的死亡率分别为(55.40±11.40)%和(61.14±7.66)%，CFSE法检出率高于前者，差异不具有统计学意义(P=0.20)；但在10∶1组中，二者检出的死亡率则为(44.29± 9.18)%和(55.59±5.25)%，差异具有统计学意义(P=0.01)，CFSE/7-AAD法较为敏感。

HLA Ⅰ 类抗原与NK细胞表面的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)分子相配位，共同调节NK细胞的活性。由于K562细胞缺乏与KIR相配位的HLA Ⅰ类抗原表达[12,13]，KIR分子对NK细胞的抑制作用完全被解除，NK细胞被激活。文献报道从白血病患者体内新分离的白血病原始细胞表面的HLA Ⅰ类抗原选择性下调[14,15]，NK细胞的抑制作用部分解除。因此NK细胞对K562细胞株的细胞毒作用较强，而对白血病原始细胞的细胞毒作用则受HLA Ⅰ类抗原下调水平的影响，不同程度地减弱。本实验中，两种方法所检出的NK细胞对不同白血病原始细胞的细胞毒作用，均较K562弱。在检测4株不同患者来源的白血病原始细胞中，CFSE法在10∶1和20∶1的效靶比下，检出的靶细胞死亡率均高于Calcein-AM释放法，各组中差异均具有统计学意义 (P<0.05)，详见表2。但在细胞死亡率较低时，Calcein-AM释放法的MFI变化微弱，不能准确地计算出相对变化值，对靶细胞死亡率的计算不准确。但CFSE法则可以通过对实验细胞群中对CFSE+7/AAD+细胞进行分析，直观的呈现靶细胞死亡率，不依赖MFI变化。

以往研究者报道的靶细胞标记方法，如：张嘉等[16,17]对靶细胞进行增强荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)标记，借由EGFP在FL-1通道的荧光来区别靶细胞与效应细胞。但该法需要预先对细胞进行转染，使靶细胞携带有EGFP基因，进而表达荧光蛋白。此法延长了实验周期，对于新分离的白血病原始幼稚细胞而言，体外培养则可能引发表型改变，与患者体内的白血病原始幼稚细胞存在差异。Ozdemir等[18]利用K562白血病原始幼稚细胞系表达CD33这一细胞表面抗原，使用抗CD33特异性荧光抗体对靶细胞进行标记，进而在CD33+细胞群中分析靶细胞死亡率。但对于一些不表达细胞表面特异性标志物的肿瘤细胞，抗体标记法并不适用；且抗体标记法的标记强度取决于靶细胞表面抗原表达密度，标记某些在细胞表面表达较少的特异性抗原时，则难以很好地标记靶细胞。

综上所述，本文比较了Calcein-AM释放法及CFSE/7-AAD双染色法，在不同效靶比分别对K562细胞株和不同患者来源的白血病原始细胞进行了细胞毒实验结果。两种染色方法均能对不同的靶细胞进行有效标记和区分；在较高的效靶比和较强的细胞毒作用(如：对K562细胞)下，两种方法对靶细胞死亡率检出的差异不具有统计学意义；但在细胞毒作用较弱的情况下，CFSE/7-AAD双染法检测白血病原始细胞的死亡率优于Calcein-AM单染法，具有重复性好、操作简便、灵敏度高等特点。