大蒜素通过调控miR-27a抑制高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症因子和纤维化成分表达

江 辉 陈小枚 邱 泱 吴森超 王福珍（福建医科大学附属龙岩第一医院肾内科，龙岩 364000）

糖尿病肾病是糖尿病全身微血管病并发症之一，通常合并其他器官或系统微血管病，如糖尿病视网膜病变和外周神经病变［1-2］。1型糖尿病并发糖尿病肾病多发生于发病10~15年，而2型糖尿病并发糖尿病肾病时间较短，与患者年龄较大、合并较多其他基础疾病有关［3-4］。大蒜素是从葱科葱属植物大蒜的鳞茎（大蒜头）中提取的一种有机硫化合物，也存在于洋葱和其他葱科植物，具有抗炎、抗菌、抗高血压、抗肿瘤、抗氧化应激等作用［5-6］。miR-27a是一类具有转录后调节功能的单链RNA分子，在多种疾病中发挥重要作用。研究显示，糖尿病肾病中miR-27a表达上调［7-8］。大蒜素能否通过miR-27a影响高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症因子和纤维化成分表达尚不清楚。本研究拟探究大蒜素通过调控miR-27a表达对高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症因子和纤维化成分表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 大蒜素购自中国药品生物制品鉴定所，用DMSO稀释为100 mmol/L储备液，−20℃保存备用；人肾小管上皮细胞HK-2购自美国ATCC公司（批号：FS-0054）；DMEM低糖培养基（批号：SH-10354）、DMEM高糖培养基（批号：AAF201832）、胎牛血清（FBS，批号：SV26052）、胰蛋白酶（批号：SH-25213）购自美国Hyclone公司；MTT试剂盒（批号：AR0953）购自武汉博士德生物工程有限公司；Trizol试剂（批号：15575012）、逆转录试剂盒（批号：13268052）购自美国Invitrogen公司；ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；PVDF膜（批号：20201204）购自北京索莱宝生物科技公司；一抗、二抗购自北京天根生化科技有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 采用含10%FBS的DMEM培养基培养人肾小管上皮细胞HK-2，37℃、5%CO2中培养，细胞90%左右融合时，0.25%胰蛋白酶消化传代进行后续试验，分为NG组（含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM低糖培养基）、HG组（含25 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培养基）、HG+不同剂量大蒜素处理组（HG+2.5、5.0、10.0、20.0 µg/ml大蒜素）；将miR-NC、miR-27a、anti-miR-NC、anti-miR-27a转染至HK-2细胞进行高糖处理，作为HG+miR-NC组、HG+miR-27a组、HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-27a组；将大蒜素与miR-NC、大蒜素与miR-27a共转染至HK-2细胞并进行高糖处理，作为HG+大蒜素+miR-NC组、HG+大蒜素+miR-27a组。培养48 h进行后续实验。

1.2.2 MTT检测细胞活性 取生长状态良好的各组细胞，制成密度为1×104个/ml的单细胞悬液并接种至96孔板，20µl/孔加入MTT试剂（5 mg/ml）37℃孵育4 h，150 µl/孔加入DMSO反应10 min，酶标仪检测490 nm处OD值，以OD值换算表示细胞活性。

1.2.3 RT-qPCR检测细胞miR-27a表达 取生长状态良好的各组细胞，总RNA试剂盒提取细胞RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行qRTPCR反应，2−ΔΔCt计算相对表达。反应条件为：95℃1 min，94℃15 s，58℃20 s，72℃45 s，共40个循环。miR-27a以U6为内参。miR-27a正向引物：5'-CGGCGGTTTCACAGTGGCTAAG-3'，反向引物5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.4 ELISA检测细胞IL-1β、IL-8和MCP-1炎症因子水平 取生长状态良好的各组细胞，取上清，按照ELISA试剂盒说明检测上清中IL-1β、IL-8和MCP-1炎症因子水平。

1.2.5 Western blot检测细胞E-cadherin、α-SMA蛋白表达 取生长状态良好的各组细胞，细胞裂解法提取总蛋白，BCA检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭3 h，加入一抗（E-cadherin 1∶1 000稀释、α-SMA 1∶800稀释）4℃封闭过夜，加入二抗（β-actin 1∶2 000）37℃孵育1 h。以β-actin为内参，分析条带灰度值，计算蛋白表达。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0和Graphpad Prism 7.0软件进行数据分析，数据以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2活性的影响 与NG组比较，HG组细胞活性显著降低（P<0.05）；与HG组比较，HG+2.5、5.0、10.0、20.0 µg/ml Allicin组细胞活性显著增强（P<0.05，表1）。选取20.0µg/ml大蒜素进行后续实验。

表1 不同剂量大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2活性的影响（±s，n=9）Tab.1 Effects of different doses of Allicin on activity of hu⁃man renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9）

表1 不同剂量大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2活性的影响（±s，n=9）Tab.1 Effects of different doses of Allicin on activity of hu⁃man renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05.

Groups NG HG HG+2.5µg/ml Allicin HG+5.0µg/ml Allicin HG+10.0µg/ml Allicin HG+20.0µg/ml Allicin F P Cell viability（%）100.23±9.02 46.92±4.381）65.42±5.802）73.16±6.602）82.01±7.712）89.62±6.082）350.127<0.001

2.2 大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2炎症水平的影响 与NG组比较，HG组炎症因子IL-1β、IL-8、MCP-1水平显著上调（P<0.05）；与HG组比较，HG+Allicin组炎症因子IL-1β、IL-8、MCP-1水平显著下调（P<0.05，表2）。

表2 大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2炎症因子水平的影响（±s，n=9，ng/L）Tab.2 Effect of Allicin on inflammation levels of human renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9，ng/L）

表2 大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2炎症因子水平的影响（±s，n=9，ng/L）Tab.2 Effect of Allicin on inflammation levels of human renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9，ng/L）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group 2）P<0.05.，

Groups NG HG HG+Allicin F P IL-1β 9.32±1.03 23.09±3.211）13.82±2.222）264.038<0.001 IL-8 9.38±1.18 26.78±4.281）14.68±3.702）283.097<0.001 MCP-1 18.62±4.81 68.92±6.511）25.62±4.482）255.573<0.001

2.3 大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2相关蛋白表达的影响 与NG组比较，HG组E-cadherin蛋白表达显著下调，α-SMA蛋白表达显著上调（P<0.05）；与HG组比较，HG+Allicin显著上调E-cad‐herin蛋白表达；显著下调α-SMA蛋白表达（P<0.05，图1、表3）。

表3 大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2相关蛋白表达的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of Allicin on related protein expressions in hu⁃man renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9）

表3 大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2相关蛋白表达的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of Allicin on related protein expressions in hu⁃man renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05.

Groups NG HG HG+Allicin F P E-cadherin protein 0.98±0.09 0.24±0.021）0.78±0.072）173.252<0.001 α-SMA protein 0.96±0.09 2.68±0.671）1.15±0.452）192.317<0.001

图1 大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2 E-cadherin α-SMA蛋白表达的影响Fig.1 Effect of Allicin on E-cadherin and α-SMA protein expressions in human renal tubular epithelial cells HK-2、

2.4 大蒜素对miR-27a表达的影响 与NG组比较，HG组细胞miR-27a表达显著上调（P<0.05）；与HG组比较，HG+Allicin组细胞miR-27a表达显著下调（P<0.05，表4）。

表4 大蒜素对miR-27a表达的影响（±s，n=9）Tab.4 Effect of allicin on miR-27a expression（±s，n=9）

表4 大蒜素对miR-27a表达的影响（±s，n=9）Tab.4 Effect of allicin on miR-27a expression（±s，n=9）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05.

Groups NG HG HG+Allicin F P miR-27a 1.02±0.10 3.82±0.671）1.44±0.162）167.035<0.001

2.5 miR-27a对人肾小管上皮细胞HK-2活性、炎症和纤维化的影响 与HG+miR-NC组比较，HG+miR-27a组细胞活性、E-cadherin蛋白表达显著下调，IL-1β、IL-8、MCP-1炎症因子水平及α-SMA蛋白表达显著上调（P<0.05）；与HG+anti-miR-NC组比较，HG+anti-miR-27a组细胞活性、E-cadherin蛋白表达显著上调，IL-1β、IL-8、MCP-1炎症因子水平及α-SMA蛋白表达显著下调（P<0.05，图2、表5）。

图2 miR-27a对人肾小管上皮细胞HK-2 E-cadherin、α-SMA蛋白表达的影响Fig.2 Effect of miR-27a on E-cadherin and α-SMA pro⁃tein expressions in human renal tubular epithelial cells HK-2

表5 miR-27a对人肾小管上皮细胞HK-2活性、炎症和纤维化的影响（±s，n=9）Tab.5 Effect of miR-27a on activity，inflammation and fibrosis of human renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9）

表5 miR-27a对人肾小管上皮细胞HK-2活性、炎症和纤维化的影响（±s，n=9）Tab.5 Effect of miR-27a on activity，inflammation and fibrosis of human renal tubular epithelial cells HK-2（±s，n=9）

Note：Compared with HG+miR-NG group，1）P<0.05；compared with HG+anti-miR-NC group，2）P<0.05.

Groups HG+miR-NC HG+miR-27a HG+anti-miR-NC HG+anti-miR-27a F P Cell viability（%）88.62±8.33 42.31±2.801）45.62±4.09 90.85±5.572）489.035<0.001 IL-1β/（ng·L−1）8.20±1.27 25.62±4.901）27.06±5.22 7.05±0.942）402.318<0.001 IL-8/（ng·L−1）8.83±1.26 24.68±3.071）25.85±3.01 10.36±1.002）392.079<0.001 MCP-1/（ng·L−1）17.20±3.33 65.08±5.571）62.09±6.66 15.06±0.582）452.019<0.001 E-cadherin protein 0.88±0.10 0.28±0.031）0.32±0.03 0.90±0.082）285.741<0.001 α-SMA protein 0.89±0.09 2.53±0.401）2.49±0.22 0.91±0.112）293.854<0.001

2.6 miR-27a过表达逆转大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2活性、炎症和纤维化的影响 与HG+Alli‐cin+miR-NC组比较，HG+Allicin+miR-27a组细胞活性、E-cadherin蛋白表达显著下调，IL-1β、IL-8、MCP-1炎症因子水平及α-SMA蛋白表达显著上调（P<0.05，图3、表6）。

图3 miR-27a过表达逆转大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2 E-cadherin、α-SMA蛋白表达的影响Fig.3 miR-27a over-expression reverses effect of Allicin on E-cadherin and α-SMA proteins expressions in human renal tubular epithelial cells HK-2

表6 miR-27a过表达逆转大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2活性、炎症和纤维化的影响（±s，n=9）Tab.6 miR-27a over-expression reverses effect of allicin on activity，inflammation and fibrosis of human renal tubular epi⁃thelial cells HK-2（±s，n=9）

表6 miR-27a过表达逆转大蒜素对人肾小管上皮细胞HK-2活性、炎症和纤维化的影响（±s，n=9）Tab.6 miR-27a over-expression reverses effect of allicin on activity，inflammation and fibrosis of human renal tubular epi⁃thelial cells HK-2（±s，n=9）

Note：Compared with HG+Allicin+miR-NC group，1）P<0.05.

Groups HG+Allicin+miR-NC HG+Allicin+miR-27a t P Cell viability（%）89.62±6.08 40.36±2.501）153.247<0.001 IL-1β/（ng·L−1）10.30±1.54 25.55±2.211）172.017<0.001 IL-8/（ng·L−1）11.44±1.28 28.89±3.191）179.435<0.001 MCP-1/（ng·L−1）16.69±3.33 72.31±7.771）126.941<0.001 E-cadherin protein 0.95±0.08 0.29±0.031）98.089<0.001 α-SMA protein 0.97±0.09 2.52±0.411）86.667<0.001

3 讨论

糖尿病肾脏病是糖尿病最严重的并发症之一，是糖尿病的微血管并发症，主要为糖尿病性肾小球硬化症（一种以血管损害为主的肾小球病变），早期多无症状，血压正常或偏高，发生率随糖尿病病程延长而增高［9-10］。

本研究通过高糖诱导肾小管上皮细胞结果显示，与NG组比较，HG组细胞活性显著下调；与HG组比较，HG+2.5、5.0、10.0、20.0µg/ml Allicin组细胞活性显著增强。与NG组比较，HG组炎症水平显著上调；与HG组比较，HG+Allicin组炎症水平显著下调。与NG组比较，HG组E-cadherin蛋白表达显著下调，α-SMA蛋白表达显著上调；与HG组比较，HG+Allicin组E-cadherin蛋白表达显著上调，α-SMA蛋白表达显著下调，与既往研究结论一致［11］。提示大蒜素通过抑制JAK2/STAT3信号通路活化从而抑制高糖诱导的HK-2细胞分化。

miRNA在糖尿病肾病发病机制中起促癌或抑癌作用，研究发现，miR-27a高表达促进高糖诱导肾小管上皮细胞纤维化［12］。曹旭等［13］研究发现，miR-503通过靶向调控Bcl-2介导高糖诱导的人肾小管上皮细胞凋亡。糖尿病肾病小鼠模型显示，miR-25-3p呈低表达，miR-25-3p通过靶向TLR4减轻糖尿病肾病小鼠炎症反应，保护肾脏［14］。邹美娜等［15］研究发现，高糖环境下miR-324-3p表达明显增加，miR-324-3p可能通过降低Bcl-2/Bax增加cleaved caspase-3表达，促进细胞凋亡。付婷婷等［16］研究发现，miR-223靶向NLRP3影响高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT发生。李锴等［17］研究发现，miR-93-3p通过调控PI3K/AKT信号通路抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤及炎症因子分泌，提示miRNA与糖尿病肾病密切相关。本研究中，与NG组比较，HG组细胞miR-27a表达显著上调，与HG组比较，HG+大蒜素组miR-27a表达显著下调，说明大蒜素可调控miR-27a表达，进一步研究显示，与HG+大蒜素+miR-NC组比较，HG+大蒜素+miR-27a组细胞活性、E-cad‐herin蛋白表达显著下调，炎症水平及α-SMA蛋白表达显著上调，说明大蒜素可调控miR-27a表达在糖尿病肾病中发挥作用。

综上，大蒜素通过下调miR-27a表达抑制高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症和纤维化成分表达。