配子及胚胎冷冻对子代远期健康影响的研究进展 *

高 洁，姜 啸，崔琳琳**

(1.山东大学附属生殖医院女性生殖科，济南 250021；2.山东大学齐鲁医院妇产科，济南 250012)

目前应用于临床的生育力保存手段主要包括：卵子冷冻保存、精子冷冻保存、胚胎冷冻保存、睾丸组织冷冻保存以及卵巢组织冷冻保存，其中配子冷冻保存(卵子、精子)和胚胎冷冻保存是辅助生殖技术(assistant reproductive technology，ART)治疗过程中最常用技术之一。国际首例冻融精子、胚胎和卵子妊娠婴儿分别出生于1983年、1984年和1986年。自此,该技术在生殖医学临床领域开始得到广泛应用。2020年中华生殖医学会调查显示2013年冻胚移植周期占全周期的比例为34.8%[1]，至2016年冻胚移植周期比例已增至40.5%[2]。由此可见，冻胚移植周期大有超过新鲜周期成为ART移植主导的趋势。然而无论是配子还是胚胎的冻融均属于生命早期的非生理性暴露。有研究表明，妊娠女性冻融周期的孕产期结局与新鲜周期存在差异，并且根据健康与疾病的发育起源(Developmental Origins of Health and Disease)理论，这些暴露的影响还可能映射到子代的远期健康上。本文通过对冷冻复苏技术对配子、胚胎以及基于此技术妊娠的后代的潜在影响及相关机制研究进行综述，旨在深入探讨该技术对后代的近期和远期安全性，为临床应用和相关管理政策提供理论依据。

1 基于冷冻技术的生育力保存

生育力保存技术是指通过特定的技术在零下温度将细胞或组织冷冻，以降低生物代谢活动，从而保存以备后续使用的技术，主要包括卵子冷冻、精子冷冻、胚胎冷冻以及卵巢和睾丸组织的冷冻保存。

1.1 冷冻复苏技术 生育力保存常用的冷冻方法主要有慢速程序冷冻法和玻璃化冷冻。慢速程序冷冻法，即冷冻降温的速度慢，它可使细胞充分脱水，减少细胞内冰晶的形成进而减少冰晶对细胞的损害。目前临床主要应用的是玻璃化冷冻，它可通过较快的冷冻降温速率，使细胞内外黏度增高固化成玻璃样，从源头上阻止冰晶形成，并且减少了渗透损害。玻璃化冷冻又分为开放性和封闭性。开放性玻璃化冷冻是指样本直接与液氮接触，理论上来说，液氮中的微生物或细菌污染样本的可能性增大。封闭性玻璃化冷冻则将样本与液氮分开放置，研究提示这有效地减少了上述污染风险。但与开放性玻璃化冷冻相比，封闭性冷冻妊娠率相对低，所以临床更倾向于使用开放性冷冻。为了达到冷冻的标准以及消除病原体污染的潜在风险，近期研究提出半自动玻璃化冷冻方法。有研究比较了半自动玻璃化冷冻和开放性冷冻的胚胎发育情况，发现两种方法冻融后2PN卵母细胞的存活率以及胚胎发育并无显著差异[3]。

冷冻保护剂主要用于在低温保存生物样品过程中降低细胞的冷损伤，分为渗透性和非渗透性保护剂。冷冻配子和胚胎最常用的渗透性冷冻保护剂有甘油、甲醇、乙二醇(EG)、丙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、胺等。研究表明，渗透性冷冻保护剂随着浓度的增加，其毒性也增强[4]。玻璃化冷冻最常用的非渗透性的冷冻保护剂有蔗糖和海藻糖,它们可有效减少卵母细胞及胚胎对渗透休克的敏感性。此外，复温的过程对于冷冻配子及胚胎的生存率也非常重要。它主要是通过逐步降低冷冻保护剂的浓度，让渗透压逐渐降到最低，进而去除冷冻保护剂的作用，从而达到复温的目的。

1.2 临床应用 该技术最初应用于年轻肿瘤患者。放化疗和部分手术治疗会导致患者的生育能力下降约40%[5]，因此治疗前患者可通过冷冻技术保存生育能力。在ART领域，以胚胎冷冻为主的生育力保存起初主要用于ART治疗过程中富余生育力的保存和并发症的预防。但近年来随着ART的广泛应用，由于胚胎冷冻具有提高部分特殊患者妊娠成功率、规避不良宫腔环境以及备行胚胎遗传检测等优点，“全胚冷冻”策略有成为ART移植主导选择趋势。

控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)是ART治疗的首要环节，而卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)是COH最主要的并发症之一，主要表现为血管通透性增加引起的第三腔隙积液以及高雌激素导致的血液高凝，相关症状会因妊娠而进行性加重[6]。多中心随机对照临床研究表明，全胚冷冻策略可显著降低OHSS的发生风险、减轻其症状严重程度[7]。对于多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)患者，全胚冷冻可以增加其ART助孕成功率和活产率，因而得到广泛应用[8]。胚胎植入前遗传学检测技术(preimplantation genetic testing，PGT)主要应用于有遗传疾病风险、复发性流产及高龄患者，由于胚胎需要在取样后等待遗传检测结果，因此全胚冷冻也是其运行的必要条件。此外，对于如宫腔粘连、子宫内膜息肉等宫腔病变以及其它不适于妊娠的急性疾病患者来说，全胚冷冻也成为一个重要的缓冲方法，为重新准备适合胚胎植入的宫腔环境提供更好的机会。

除胚胎冷冻外，卵子和精子的冷冻也是目前常用的生育力保存技术。前者主要用于ART过程中有卵子富余或因男方因素无可用精子的情况，也可用于无法进行体外受精时的生育力保存(如未婚女性)，但是目前我们国家不允许未婚女性行卵子冷冻来保存生育力。后者除用于男性生育力保存外，更主要的用途是支撑精子库。

2 冷冻复苏对后代的潜在影响及机制

研究表明,ART子代出生缺陷及部分新生儿结局风险的增加与配子及胚胎体外操作有关，尤其是冷冻损伤。冷冻对配子或胚胎损伤的评估主要是根据细胞的形态、功能、遗传变化来判断的，其机制涉及冷冻保护剂的毒性、细胞内外冰晶的形成、溶解效应、渗透损伤等。

2.1 精子冻融 有研究发现，虽然冷冻对精子的DNA造成了损伤[9]，该损伤可能会影响胚胎发育，但是与新鲜精子相比，其优胚率、临床妊娠率、活产率差异无统计学意义。Chen等[10]研究发现，与夫精人工授精(artificial insemination with husband's semen，AIH)相比，供精人工受精(artificial insemination with donor's semen,AID)的子代出生体重明显增加，这与之前研究提出的冷冻子代巨大儿发生率高的结果相一致。还有研究报道AID妊娠的子代有印记基因障碍[11]，这提示冻精妊娠后代表观遗传改变可能，但个案报告证据级别有限，还需高级别证据证实。

精子冷冻后微细结构、运动能力及受精功能均有一定程度的损伤[12]。结构改变主要表现为DNA损伤和质膜改变。研究发现，冷冻后人类精子mtDNA的拷贝数增加，且mtDNA拷贝数与精液参数呈负相关[13]，这表明精子冷冻后，mtDNA拷贝数增加，精液质量变差。有关精液参数的研究提示冷冻复苏的精子活动率下降、运动形态异常，特别是快速前向运动精子的比例明显下降，精子顶体酶的活性降低，可能原因是冷冻复温后精子膜的通透性增加，导致线粒体肿胀、功能障碍，或精子内容物漏失，精子能量代谢降低或停止。目前研究认为，冷冻造成精子损伤的一个重要原因是精子内氧自由基与抗氧化剂的平衡破坏，产生过量的氧化应激反应(oxidative stress response,ROS)，使膜脂质过氧化，破坏了精子的超微结构，从而导致精子的形态或功能异常[14]。上述所说的mtDNA拷贝数增加的机制可能也与ROS有关，有研究猜测可能是ROS损坏了线粒体氧化呼吸链，抑制了ATP的合成，从而使mtDNA代偿性增加[15]。此外,还有研究发现，冷冻精子复苏过程中精子DNA损伤加重，可能与高活性氧水平或氧化还原失衡有关[16]。

2.2 卵子冻融 有研究表明,冻融卵子的受精率、胚胎着床率、临床妊娠率、持续妊娠率以及活产率与新鲜卵母细胞相当[17]。Seshadri等[18]比较了应用冻融卵子和新鲜卵子女性的孕产期结局，两者临床妊娠率、活产率及新生儿出生体重无显著差异，产前出血、妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病、胆汁淤积症和胎膜早破等并发症的发生率也无显著差异。但有研究提出前者妊娠期高血压疾病发生率更高。与自然妊娠子代相比，冻融卵子妊娠子代的新生儿结局，如出生体重、身长、胎龄、小于胎龄儿发生率、Apgar评分、新生儿住院率和出生缺陷也无显著差异[18]。近期有一项研究发现，冻融和新鲜卵子的子代在2岁时的人体测量参数没有明显差异[19]。但目前关于后代远期结局的研究尚少，仍有待进一步研究。

影响卵子冷冻后的存活、受精及卵裂产生的因素可能有：卵母细胞的体积、质量、所处的成熟阶段以及其周围包绕的颗粒细胞等。Camargos等[20]对于人类卵子冷冻前后形态的变化研究发现，冻融后的卵子在通过卵胞浆内单精子显微注射(intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI)受精后，未能成功受精卵子的总直径和卵黄周围间隙的收缩比成功受精的卵子大，这可能是由于卵子受到冷冻损伤或者渗透性休克导致。但研究发现玻璃化冷冻复苏的卵子与新鲜卵子形态学参数没有差异。冷冻对卵子造成损伤的原因可能是它导致了皮层颗粒过早的释放，破坏了糖蛋白等,阻碍了纺锤体分离，改变了线粒体功能，使透明带硬化，从而使受精能力下降[21]。哺乳动物卵母细胞微管微丝对正常染色体分离至关重要，已有研究表明冷冻可能破坏微管微丝的稳定性，即卵子在非生理温度时裂变的纺锤体形成的微管倾向于解聚其结构，导致卵母细胞的染色体不能正常分离，这有可能会导致胚胎非整倍体，甚至子代异常核型的出现。此外，卵子冷冻保存会导致皮质颗粒内酶的过早释放，较早作用于透明带的糖蛋白交联，从而阻碍精子的穿透，影响受精；冷冻保存还会导致卵母细胞透明带的物理损伤，从而导致多个精子进入，因此冻融卵子受精需采用ICSI，ICSI相关的后代风险也是冻融卵子妊娠后代需要重点关注的问题。

2.3 胚胎冻融 关于冻融胚胎和新鲜胚胎移植的结局有较多研究报道，多认为前者大于胎龄儿(large for gestational age，LGA)发生率、母亲妊娠期高血压、围产期疾病(胎盘相关疾病)的发病风险增高，并且胎儿染色体异常、胎儿畸形的几率增加[22]。有研究报道，冻融周期的巨大儿发生风险比新鲜周期增加约1.5倍，与自然妊娠相比，增加约1.3倍[23]，可见移植冻融胚胎也增加了剖宫产的几率。但也有研究提出,冻融胚胎移植的母亲出现产后出血、胎盘早剥、前置胎盘相对风险较低，早产儿、小于胎龄儿、低体重儿及围产期死亡的发生率较低。目前关于其后代远期健康的研究较少且结果存有争议，Hattori等[24]观察到移植冻融胚胎会增加一些罕见印记基因的疾病的发生率，如安吉尔曼综合征等，可能会影响子代的远期健康。研究发现，冻融胚胎子代巨大儿发生风险的增加可能会导致子代发生肥胖的概率增加，甚至容易患上代谢异常的疾病[25]，但Ainsworth等研究了移植冻胚与鲜胚的新生儿和儿童期体重及发育轨迹的变化，发现冻融胚胎移植的新生儿出生体重和儿童的生长轨迹与新鲜周期没有明显不同[26]。

冷冻对胚胎造成损伤的因素主要有冰晶形成造成的机械性损伤，冷冻保护剂的渗透性损伤以及降温导致的冷休克损伤等。研究表明，冷冻保存技术可能导致卵裂球损伤以及冻融胚胎发育停滞，而且冷冻时间过长有可能会对基因的稳定性产生不良影响，进而导致胚胎DNA碎片的增加、线粒体DNA的突变等改变[27]。但最近一项研究发现，冷冻时间长短与妊娠相关的并发症，如妊娠期糖尿病、高血压等的发生没有明显的相关性[28]。另外，动物实验研究发现，冷冻带来的损伤可能会导致胚胎表观遗传学改变，如DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等。多组学研究表明，这种改变多发生在与神经系统、心血管系统及糖脂代谢相关的过程中[29]，这提示冷冻所导致的胚胎表观遗传学变化，可能会影响子代远期健康。动物实验还发现，冷冻对胚胎造成的损伤可能通过降低葡萄糖转运蛋白GLUT1表达来影响胚胎发育，该结论仍需进一步研究证实。此外，近期一项研究构建了一种特殊的小鼠模型用于研究胚胎冷冻和超排卵环境的独立影响，发现不是冷冻过程，而是超排卵环境会影响胎盘血管生成，改变胎儿生长[30]。

综上所述，尽管冷冻复苏技术已广泛应用于生殖临床，但其对配子和胚胎的结构和功能的影响仍不可忽视。冻融配子和胚胎诞生的子代其新生儿结局与新鲜周期相比存在一定差异，其机制涉及物理损伤、氧化应激损伤和表观遗传修饰等。但更重要的是这些影响并非“全”或“无”的，而是可能通过某些机制(如表观遗传)成为镌刻在后代生命中的标签，对其远期健康产生深远影响。目前对于后代近远期健康的研究仍较少，而且对于需同时经历配子和胚胎多次冻融过程的后代是否存在叠加效应均需进一步研究证实。对于冻融影响配子和胚胎的具体机制也需深入探索，以进一步评估和提升该技术的安全性。