孕中期热暴露后子宫缺血对子代大鼠宫内生长发育的影响 *

彭永保,刘 淮**,周 群,张俊明

(1.南昌大学附属妇幼保健院，南昌 330006；2.江西省药物研究所，南昌 330012)

胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)是指胎儿在母体内因遗传或环境因素的影响而未达到其生长潜能[1]。FGR是目前产科最为常见的疾病之一，高居胎儿围产期死亡病因的第二位[2]。孕期胎盘血流灌注不足是导致FGR发生的重要原因，但目前机制尚不明确。有学者认为，子宫血流灌注不足引起胎盘缺血缺氧，诱发滋养细胞凋亡异常增加，进而引起胎盘功能异常可能是FGR发生、发展的病理机制之一[3-4]。本课题组前期研究发现，FGR及FGR合并子痫前期的发病率在炎热季节明显高于寒冷季节和过渡季节[5]。一些研究也证实，孕期胚胎暴露于高温环境可引起胚胎发育迟缓，甚至胚胎死亡率明显增加[6-7]。热暴露是否通过影响子宫、胎盘血流灌注而影响胚胎的发育，目前还缺乏有力的证据。本研究拟通过构建孕中期热暴露后子宫缺血模型，观察热暴露后子宫缺血对子代宫内发育的影响及胎盘HSP70、Bax、Bcl-2等蛋白表达的变化，探索高温应激增加FGR发生的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 12周龄SPF级SD大鼠54只，其中雌性36只，雄性18只，体重200～250g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物合格证编号：SCXK(湘)2011-0003。置于室内温度(23±1)℃、相对湿度55%～70%的环境中适应性饲养7d。人工气候培养箱购于上海慧泰仪器制造有限公司；兔抗大鼠HSP70、Bax、Bcl-2抗体,鼠抗大鼠HSP70、Bax、Bcl-2抗体,兔抗大鼠β-actin抗体均购于美国Proteintech公司。

1.2 研究方法

1.2.1 动物模型制备与分组 将54只大鼠随机分为3组，每组18只(雌性12只、雄性6只),雌、雄2∶1合笼过夜,次日上午做阴道涂片，按SD大鼠孕期为3周推算，发现阴栓当日为妊娠第1天，观察期设定为妊娠第21天。热暴露组(Ⅰ组)：妊娠第1～7天环境温度控制在(23±1)℃，第8天上午转移至温度(35±1)℃人工气候箱，第14天上午移回至(23±1)℃环境中饲养；子宫缺血组(Ⅱ组)：孕期全程环境温度控制在(23±1)℃，妊娠第14天行双侧子宫动静脉部分结扎；热暴露后子宫缺血组(Ⅲ组)：妊娠第1～7天环境温度控制在(23±1)℃，第8天上午移置温度(35±1)℃人工气候箱，第14天行双侧子宫动静脉部分结扎，移回至(23±1)℃环境中饲养。3组大鼠饲养过程中均保持相对湿度在55%～70%，自由饮食。

子宫缺血模型的建立：妊娠第14天以0.3%戊巴比妥(1mL/100g体重)行腹腔麻醉，开腹后暴露双侧子宫动静脉，选择子宫血管中段以1-0号微乔缝合线作衬垫，以4-0号丝线结扎子宫双侧动静脉血管，抽出微乔线，还纳子宫、关腹。

1.2.2 观察指标 在妊娠第1、8、14、21天测量并记录孕鼠的体质量。妊娠第21天，两组孕鼠用0.3%戊巴比妥(1mL/100g体重)行腹腔麻醉后行剖腹取胎，暴露腹主动脉，从中采血3mL。检测存活胎鼠的数量、体重、性别、身长、尾长、外观有无畸形、胎盘重量及死胎数、胎死率。计算孕鼠孕期体重增加值(妊娠第21天体重-妊娠第1天体重)。胎盘组织称重，迅速放置液氮冻存。血液标本采集，置抗凝管，3000r/min，离心10min，吸取上层血清，-80℃冰箱保存。

1.2.3 Western blot法检测胎盘组织中HSP70、Bax、Bcl-2等蛋白表达 取胎盘与子宫剥离面滋养细胞相对丰富部位胎盘组织,经蛋白提取、浓度测定、蛋白变性、电泳分离及转膜后进行免疫印迹，经封闭、加抗体、洗膜，用增强化学发光剂(ECL)进行发光后再行曝光显影，将显影条带放Alpha ImagerTM2200图像分析处理系统，利用AlphaEase4.0软件，电脑直接扫描测定显影条带积分光密度值(350nm)，条带的积分光密度值(IDV)即表示蛋白表达量，并计算每份样本中目的蛋白的相对表达量(目的蛋白/β-actin)以及Bax与Bc1-2的比值(Bax/Bc1-2)。

1.2.4 ELISA法检测母鼠血清HSP70水平 在预先包被好抗体的包被微孔中，依次加待测样本、生物素标记物和酶联亲和素，经温育后彻底洗涤，加底物显色，用酶标仪在450nm波长下读取吸光度(A)值，绘制标准曲线，计算待测样本的HSP70水平。

2 结 果

2.1 孕鼠的一般情况及体重变化 3组均有11只雌鼠参与雌雄合笼过夜并次日阴道图片阳性。但子宫缺血组、热暴露后子宫缺血组分别有1只和2只孕鼠妊娠21天解剖子宫未发现胚胎。目前尚不能确定是由于受孕未成功还是怀孕后早期流产导致。将这些大鼠退出本实验。妊娠第1天、第8天,3组的孕鼠体重比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。妊娠第14天，子宫缺血组的孕鼠体重高于热暴露组和热暴露后子宫缺血组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，热暴露组和热暴露后子宫缺血组差异无统计学意义(P>0.05)；妊娠第21天，热暴露后子宫缺血组的孕鼠体重低于热暴露组和子宫缺血组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，热暴露组和子宫缺血组差异无统计学意义(P>0.05)；热暴露后子宫缺血组的孕鼠孕期体重增加值低于热暴露组和子宫缺血组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，热暴露组、子宫缺血组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 3组孕鼠体重变化情况

2.2 胎鼠发育指标与胎盘重量 3组孕鼠的窝产仔量无显著差异。热暴露后子宫缺血组的胎死率明显高于热暴露组和子宫缺血组(均P<0.05)，窝活胎数低于热暴露组和子宫缺血组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；所有胎鼠均未发现外观残缺或畸形。3组胎鼠体重、身长、尾长比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。热暴露后子宫缺血组的胎盘重量均低于热暴露组和子宫缺血组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，后两组差异无统计学意义(P>0.05)(表2、3)。

2.3 胎盘HSP70、Bax、Bcl-2表达及循环HSP70水平比较 3组胎盘组织中HSP70表达水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。3组胎盘组织中Bax/Bcl-2比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。热暴露后子宫缺血组孕鼠血浆HSP70水平高于热暴露组和子宫缺血组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，但后两组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表4、图1)。

表2 3组孕鼠子代一般资料比较

表3 3组胎鼠发育指标与胎盘重量比较

表4 3组胎盘HSP70、Bax、Bcl-2及循环HSP70相对表达量

3 讨 论

高温应激与子宫血流灌注不足都是引发FGR的重要因素[8-9]。本研究结果显示，热暴露后子宫缺血组孕鼠体重增加显著减缓，胎死率明显增加。表明高温应激与子宫血流灌注不足这两个病理应激会产生协同效应，进一步影响子代的宫内发育，使胎死宫内的发生率显著升高。本研究中热暴露后子宫缺血组胎鼠体重与热暴露组、子宫缺血组比较，差异无统计学意义。推测这可能与热暴露后子宫缺血组胎死率增加、窝活胎数明显少于另外两组有关。

母体因素、胎儿因素和脐带胎盘因素是引起FGR的3个主要原因，而胎盘因素被认为是最主要的[10-11]。研究发现，胎盘重量与胚胎发育密切相关，胎盘重量对胚胎生长发育的影响甚至超过胎盘的营养代谢与转运功能[12]。胎盘发育轻度异常时，可通过增加营养交换表面积，促进胎盘血管生成及降低胎盘厚度等方法来代偿[13]。但当胎盘严重发育不良时，胎盘代偿功能已经不能满足胚胎生长发育的需要，从而导致FGR的发生。本研究中热暴露组与子宫缺血组的胎盘重量无显著差异，两组孕鼠体重增加值、胎鼠体重、身长、尾长、胎死率、窝产仔量等指标也无显著差异；热暴露子宫缺血组的胎盘重量低于热暴露组和子宫缺血组，胎死率显著高于热暴露组和子宫缺血组、窝活胎数显著低于热暴露组和子宫缺血组。这进一步证明孕中期热暴露和子宫缺血都会影响胚胎的宫内发育，且它们叠加出现时造成的不利影响也具有协同效应。

研究发现，胎盘滋养细胞凋亡增加是FGR发病的重要因素[14-15]。Bax/Bcl-2是反应组织细胞凋亡的敏感指标，且比值与凋亡活跃程度成正比[16-17]。本研究中热暴露子宫缺血组胎盘组织Bax/Bcl-2比值显著高于热暴露组和子宫缺血组，且差异有统计学意义。这表明与单纯孕中期热暴露或单纯子宫缺血相比，孕中期热暴露后子宫缺血会进一步加剧胎盘滋养细胞的凋亡与坏死。这可能是造成热暴露后子宫缺血组胎盘重量低于其余两组的原因之一。陈慧萍等[18]通过比较FGR胎儿和正常胎儿胎盘组织细胞的凋亡，发现FGR患者胎盘合体滋养细胞及蜕膜细胞凋亡明显增多，提示胎盘组织细胞凋亡活跃可能是引起FGR发生、发展的重要病理过程。

HSP70是一种非特异性保护蛋白，可在机体遭遇不良应激时被刺激[19]。Mishra等[20]研究证实，高温环境可诱导细胞内热休克蛋白的表达，并起到减轻高温引起的细胞损伤作用。前期研究发现，孕中期热暴露孕鼠胎盘组织中HSP70表达明显高于正常对照组[7]。本研究中3组胎盘组织的HSP70表达无显著差异，而热暴露后子宫缺血组的母体循环HSP70水平显著高于热暴露组和子宫缺血组，且差异有统计学意义。循环中HSP70的来源目前还存有争议，应激状态下细胞的主动分泌与细胞坏死后胞内HSP70的释放入血被认为是主要的途径[21]。研究发现，循环中HSP70水平升高会给机体带来负面的影响[22-23]，甚至可诱发细胞死亡[24]。本研究显示，与热暴露组和子宫缺血组比较，热暴露子宫缺血组的循环HSP70水平高、胎盘重量降低、胎死率升高、胎盘滋养细胞凋亡增加，胎盘组织HSP70表达无显著差异。推测循环中HSP70升高并非单纯是细胞坏死增多而释放入血的结果，其更可能在FGR的发生、发展中扮演了一定的作用。

综上所述，子宫血流灌注不足和孕中期热暴露都会对胚胎的宫内发育产生不利影响，且这些不利影响都可通过诱发胎盘滋养细胞凋亡、增加母体循环HSP70表达等影响胚胎的宫内发育。当这些不利因素相互叠加时，胚胎发育所受到的不利影响也将进一步加大。有学者认为，胎盘滋养细胞分化发育不良，终末绒毛的数量、体积及表面积减少，对子宫螺旋动脉的侵蚀不足，导致胎盘血管重铸不良，胎盘交换面积及绒毛间隙减少，造成胎盘血液灌注不足，进而出现发育不良,是FGR发生、发展的重要机制[25-26]。但本研究只对胎盘的发育状况及细胞凋亡进行了分析，没有对胎盘的病理结构、血管生成与分布及交换面积等相关因素做深入的研究与分析。