一起雏鸭大肠埃希氏菌感染病例的诊断

袁玮艺，黄 凯，原 宇，郑芳芳，唐耀松，林小枫，童德文*，杜 谦*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.陕西富强宏图牧业有限公司，陕西韩城 715412)

近年来，陕西省韩城市大规模引进北京鸭良种，建设了大型规模化北京鸭养殖场，但养殖数量的增加也伴随着疾病的发生和传播速度增加，给养殖企业带来了风险和损失。在规模化鸭养殖场中鸭大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)和鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA)是常见的致病病原[1]。E.coli主要威胁2周龄～6周龄雏鸭，感染可导致鸭突然发病，病死率高，常见败血型鸭大肠杆菌病，剖检可见由于渗出导致的心包炎、肝周炎、腹膜炎和气囊炎等，但其病变与RA感染导致的鸭传染性浆膜炎临床症状相似度较高，需要实验室分离病原菌鉴别[1-2]。2020年8月，陕西省韩城市某北京鸭养殖场发生一起雏鸭急性死亡疫情，为了能及时确定病因，以便于后续有针对性地防控养殖场流行的鸭病，对养殖场送检的病死雏鸭和病危雏鸭进行病理学检验和病原学检测，为本起雏鸭急性死亡疫情的诊断提供依据，为减少北京鸭养殖企业的损失提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 陕西省韩城市某北京鸭养殖场发生雏鸭急性死亡，送检5只病死雏鸭和5只病危雏鸭，剖检采集雏鸭肝脏、脾脏、肺脏、心脏和肾脏等组织，以及心包和腹腔渗出物。

1.1.2 实验动物 4周龄～6周龄的昆明系小鼠，购自成都达硕实验动物有限公司。

1.1.3 主要试剂 2×TaqMaster Mix(Dye plus)和反转录试剂盒，南京Vazyme公司产品；DNA标准DL 5 000，北京聚合美公司产品；巧克力培养基，广东环凯微生物科技有限公司产品；血琼脂平板、TSA和抗菌药物药敏纸片，湖南比克曼生物科技有限公司产品；TSB，北京陆桥技术股份有限公司产品；DNA提取液，北京索莱宝公司产品；TRIzol，美国Invitrogen公司产品。

1.1.4 主要仪器 台式高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；PCR仪，Thermo公司产品；紫外凝胶成像系统，上海培清科技有限公司产品；电泳仪(DYY-7C)，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病理剖检 按常规方法对送检雏鸭进行剖检，观察主要脏器的病理变化，采集雏鸭肝脏、脾脏、肺脏、心脏和肾脏等组织，以及心包和腹腔渗出物用于后续检测。

1.2.2 引物合成 参考地方标准、行业标准和期刊文献等(表1)合成鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA)、鸭大肠埃希氏菌(E.coli)、鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)、鸭腺病毒Ⅰ型(Fowl adenovirus Ⅰ，FAdV Ⅰ)、鸭腺病毒Ⅱ型(FAdV Ⅱ)、鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)、番鸭细小病毒(Muscovy duckling parvovirus，MDPV)和禽流感病毒H9(Avian influ-enza virus H9，AIV H9)等病原的检测引物，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.3 组织DNA提取 将采集的雏鸭组织匀浆后在-80 ℃反复冻融，离心取上清。部分上清用于DNA的提取，加入10 mg/mL终体积SDS和0.5 mg/μL终浓度蛋白酶K，颠倒混匀1 min，56 ℃水浴30 min。加入等体积DNA提取液，振荡混匀5 min后，12 000 r/min离心5 min。吸取上清，加入等体积氯仿，混匀5 min后，室温12 000 r/min离心5 min。吸取上清，加入1/10体积2 mol/L乙酸钠和2倍体积无水乙醇，在-80 ℃过夜。4 ℃、12 000 r/min离心15 min，弃上清，加入1 mL 750 mL/L乙醇洗涤2次，4 ℃离心弃上清，自然风干后加入ddH2O溶解，置-20 ℃保存备用。

1.2.4 组织cDNA的获得 取组织冻融离心上清，加入适量TRIzol溶液，剧烈振荡10 min；加入1/5体积氯仿，充分混匀后作用5 min，4 ℃、12 000 r/min离心5 min；吸取适量上清，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温作用10 min，在-80 ℃沉淀30 min以上，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；弃上清，加入750 mL/L乙醇洗涤2次，4 ℃离心弃尽上清，风干，加入适量DEPC H2O溶解。将提取的RNA以反转录试剂盒反转录为cDNA，置-20 ℃保存备用。

1.2.5 病原PCR检测 对于不同病原分别以提取的DNA或反转录获得的cDNA为模板，采用相应特异性引物进行PCR检测。

1.2.6 细菌的培养及鉴定 将采集的心包和腹腔渗出物分别接种TSA/巧克力培养平板，37 ℃培养过夜后，挑取单个菌落进行PCR检测。

1.2.7 细菌药敏试验 利用K-B法对分离菌进行药敏试验，将纯化培养的菌液均匀涂布于TSA/巧克力培养平板，待表面菌液干燥后加入药敏纸片，37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径，判定分离菌药物敏感性。

1.2.8 动物致病性试验 以1×108CFU/mL细菌培养物，0.2 mL/只腹腔接种试验小鼠，另以无菌生理盐水0.2 mL/只注射小鼠作为对照，每组5只，连续观察5 d，记录小鼠的发病和死亡情况。

2 结果

2.1 送检雏鸭临床症状

5只送检病危雏鸭精神沉郁、头颈歪斜、呼吸困难、瘫倒无力、羽毛污秽，泄殖腔周围有污绿色排泄物(图1A和图1B)。5只病死雏鸭头颈歪斜、羽毛粗乱，部分雏鸭泄殖腔周围有污物，口腔内有黄黑色黏稠物质(图1C和图1D)。

A.病危雏鸭大体照；B.病危雏鸭头颈部；C.病死雏鸭大体照；D.病死雏鸭口腔污物

2.2 送检雏鸭剖检病理变化

对雏鸭进行剖检，打开胸腔和腹腔后，病危雏鸭各脏器界限清晰，肝略肿大、部分区域黄白色，心包有少量浆液性渗出，其余脏器无明显变化(图2A和图2B)。病死雏鸭脏器粘连，肝肿大、棕红色，心脏皱缩，肝脏表面和心包内有大量易剥离的纤维素性渗出物(图2C、图2D和图2E)。

A.病危雏鸭胸腔和腹腔脏器；B.病危雏鸭各主要脏器；C.病死雏鸭胸腔和腹腔脏器；D.病死雏鸭大量纤维素渗出；E.病死雏鸭肝脏和心脏

2.3 送检雏鸭常见病原的PCR检测

为了确定送检雏鸭是否感染了常见的病毒，采集10只送检雏鸭部分组织脏器，分别提取DNA和RNA，以提取的DNA和反转录获得的cDNA为模板，分别PCR检测鸭8种常见病原，结果显示，在所有10只雏鸭组织中均未获得DTMUV、FAdV Ⅰ、FAdV Ⅱ、DHAV、MDPV和AIV H9等病毒以及RA的特异性扩增条带，而10只雏鸭组织中均检测到大小为250 bp的E.coli阳性条带(图3)。

M.DNA 标准DL 5 000;1～10.雏鸭样品；NC.阴性对照

2.4 送检雏鸭渗出物细菌培养鉴定

将10只送检雏鸭的肝脏表面和心包渗出物分别接种LB培养平板和TSA/巧克力培养平板，37 ℃培养过夜后，在LB培养平板上生长有多量圆形、光滑、半透明灰白色菌落，在TSA/巧克力培养平板生长有较少表面光滑、圆形半透明的菌落。从LB培养平板随机挑取10个菌落后，利用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR(图4)，测序结果经NCBI Blast分析，与E.coli参考菌株的基因序列同源性均达到99%以上。

M.DNA 标准DL 5 000;1～10.菌落

2.5 药敏试验结果

药敏试验结果见表2。本试验分离的E.coli对氨苄西林、阿莫西林、新霉素、红霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、多黏菌素B和复方新诺明等药物耐药，而对庆大霉素、卡那霉素、阿奇霉素、头孢他啶、头孢氨苄、氧氟沙星和多西环素等药物敏感。

表2 鸭大肠埃希氏菌药敏试验结果

2.6 动物致病性试验

小鼠腹腔接种0.2 mL浓度为1×108CFU/mL的分离菌后，接种小鼠全部死亡，分离培养小鼠肝脏病菌，发现与病死鸭分离的E.coli形态和培养特性一致，PCR鉴定为E.coli。空白对照组小鼠全部存活。

3 讨论

规模化鸭场由于养殖密度大、鸭群生活环境潮湿、鸭舍卫生情况不达标等原因，常见多种病原感染，包括细菌性病原E.coli和RA[1-2]，病毒性病原DTMUV、FAdV Ⅰ、FAdV Ⅱ、DHAV、MDPV和AIV H9等[3-8]，这些病原往往混合感染，使患病鸭在临床上表现出复杂的症状和病理变化，给疫病的诊断带来一定的困难，造成更严重的损失。在本次北京鸭养殖场出现的病例中，我们首先通过组织PCR排除了病危雏鸭和病死雏鸭存在常见病毒的感染，推测其病变可能是由于E.coli或RA感染所致。

E.coli感染导致的鸭大肠杆菌病临床表现多种多样，有败血症、脐炎、呼吸道型、输卵管炎、腹水症、鼻窦炎、肿头和腹泻等，其中临床常见败血型鸭大肠杆菌病，患病鸭剖检可见明显的心包炎、肝周炎、腹膜炎、气囊炎，组织脏器周围可见明显的纤维素或干酪样渗出物，严重的呈现块状，可以从心血、肝脏、脾脏、脑等器官进行细菌分离[9]。但鸭大肠杆菌病的临床症状与鸭传染性浆膜炎有较高相似性，肉眼往往难以鉴别。鸭传染性浆膜炎是由RA感染导致的疾病，常表现为精神沉郁、厌食、头颈歪斜，有神经症状，病鸭眼眶和鼻孔周围有黏性分泌物，部分病鸭有呼吸道症状、咳嗽和打喷嚏等出现，粪便稀薄呈绿色或是黄绿色，典型病理变化为败血症，以及由于浆膜表面纤维素性渗出导致的心包炎和肝周炎等[10]。在本次北京鸭养殖场出现的雏鸭急性死亡病例中，基于临床症状和病理变化难以做出准确的诊断，还需要借助细菌分离培养鉴定和动物致病性试验进行鉴别诊断。本研究首先已通过PCR检测中发现，不论在病危雏鸭还是病死雏鸭组织样本中均能检测到E.coli。随后对雏鸭渗出物中的细菌进行分离培养鉴定，发现培养的菌落主要为E.coli，动物致病性试验也证实分离的E.coli能导致小鼠出现相同的症状。因此，对于这起雏鸭急性死亡病例的诊断结果为鸭大肠埃希氏菌感染所致。临床上对分离细菌主要使用抗菌药物进行治疗，但抗菌药物的广泛使用又造成了耐药菌株的出现[2，11]。本研究对分离的E.coli进行耐药性分析发现，分离的E.coli菌株主要对青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类和磺胺类抗菌药物耐药，而对头孢类和四环素类抗菌药物较敏感，为本次疫情的临床合理用药提供了依据。

在北京鸭的养殖过程中，常常因多种病原的混合感染导致出现各种类型的疾病，且这些疾病的临床症状和病理变化相似性较高，往往需要结合实验室检测方能确诊，在本起疫情的诊断过程中，通过病理学检测方法和病原学检测方法，最终确定了为鸭大肠埃希氏菌感染所致，且分离的鸭大肠埃希氏菌具有一定的耐药性，诊断结果为陕西省韩城市北京鸭养殖场的疫病防控提供了指导，为企业减少损失提供了技术支撑。