绵羊清道夫受体MARCO基因启动子克隆及生物信息学分析

陈佳阔，曹鑫艳，魏立翔，高之煜，孙延鸣，张彦兵

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000)

清道夫受体(scavenger receptors，SRs)是巨噬细胞识别、清除病原微生物的模式识别受体之一，根据其功能结构特点分为8种不同的类别(A～H)。胶原样结构巨噬细胞受体(macrophage receptor with collagenous structure，MARCO)属于A类清道夫受体(scavenger receptor class A，SRA)。Elomaa O等[1]首次从小鼠脾脏和淋巴结中克隆和鉴定了MARCO基因。研究表明，MARCO可以与多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细胞壁成分结合，例如细菌脂多糖、磷壁酸、乙酰化低密度脂蛋白等，通过识别细菌细胞壁外表面等成分，能广泛介导吞噬病原菌，在清除病原菌感染中发挥重要作用[2-3]。

MARCO在机体内的表达分布存在严格的限制，仅在肺组织、脾脏、淋巴结中高水平表达[1-4]。令人疑惑的是，与SRA的表达分布相反，MARCO在肺泡巨噬细胞中几乎不表达。Xiang X等[5]已证实MARCO在猪体内仅表达于肺组织、脾脏、淋巴结中，在猪肺泡巨噬细胞中MARCO蛋白基本不表达。绵羊MARCO基因的转录表达水平也存在组织特异性，绵羊MARCO高表达于肺组织，而在肺泡巨噬细胞表达量较低[6]。

启动子能特异性识别和结合RNA聚合酶并使之活化，在真核生物基因起始转录过程中具有重要作用[7]。那么，绵羊MARCO在肺组织和肺泡巨噬细胞表达的差异性是否与其启动子特点相关，有待于进一步研究。本研究通过克隆绵羊MARCO基因的启动子区序列，利用生物信息学方法对该序列进行预测和分析，并构建绵羊MARCO启动子荧光素酶报告基因重组载体，为将来进一步研究绵羊MARCO基因的表达调控机理提供基本材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和质粒 大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，生工生物工程有限公司产品；pGL3-Basic质粒，由中国农业科学院上海兽医研究所邱亚峰研究员馈赠。

1.1.2 主要试剂 DNA标准DL 2 000、T4 DNA连接酶、NheⅠ、XhoⅠ限制性内切酶，TaKaRa公司产品；Hieff Canace®Gold High-Fidelity DNA Polymerase，翌圣生物科技(上海)股份有限公司产品；DNA提取试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 移液器、离心机，德国Eppendorf公司产品；ABI-2720 PCR扩增仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；Alpha紫外凝胶成像仪，美国ProteinSimple公司产品；PowerPac基础型核酸电泳仪，美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)基因数据库中绵羊MARCO基因(Gene ID:101111074)的参考序列，以5′UTR上游序列约1 002 bp为参考，运用Primer Premier 5.0软件设计引物(表1)，由上海睿勉生物公司(上海)合成。

表1 引物序列

1.2.2 绵羊MARCO基因启动子PCR扩增及鉴定 利用DNA提取试剂盒提取萨福克绵羊肺组织DNA作为模板，扩增MARCO基因启动子，扩增反应体系：ddH2O 18.5 μL，上、下游引物各2 μL，2×Canace®Gold PCR buffer(含Mg2+，dNTPs)25 μL，DNA模板2 μL，Hieff Canace®Gold High-Fidelity DNA Polymerase(2 U/μL)0.5 μL；PCR反应程序：预变性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；最后72 ℃ 7 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收DNA纯化试剂盒说明回收DNA并测序。

1.2.3 绵羊MARCO基因启动子生物信息学分析 利用UCSC(https://genome.ucsc.edu/)数据库和National Center for Biotechnology Information(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库分别预测绵羊MARCO基因启动子序列；利用DNA Star Version7.1.0(44)软件比对不同数据库预测到的MARCO基因启动子序列；利用在线软件Berkeley Drosophila Genome Project(https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预测启动子可能的活性区域；利用AliBaba2.1软件(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)分析预测绵羊MARCO基因启动子上潜在的转录结合因子。

1.2.4 绵羊pGL3-MARCO载体构建和鉴定 将测序确认后的MARCO基因启动子与pGL3-Basic载体连接。具体操作如下，首先用限制性内切酶NheⅠ和XhoⅠ线性化pGL3-Basic载体，胶回收备用；连接体系：T4 DNA连接酶1 μL，线性化载体2 μL，纯化的片段15 μL，10×buffer 2 μL，16 ℃水浴反应过夜，连接产物直接转化至大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞。氨苄青霉素抗性平板筛选培养，挑取阳性克隆菌落、提取质粒，酶切鉴定。鉴定后交由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

2 结果

2.1 绵羊MARCO基因启动子扩增及鉴定

利用PCR成功扩增出绵羊MARCO基因启动子序列，大小为1 002 bp，与预期大小相符(图1)。克隆的绵羊MARCO基因启动子序列与GenBank中预测的绵羊MARCO基因启动子序列一致，表明成功克隆绵羊MARCO基因启动子序列。

M.DNA 标准DL 2 000;1.MARCO基因启动子

2.2 绵羊MARCO基因启动子生物信息学分析

2.2.1 启动子活性区域预测 通过对启动子活性区域预测，发现绵羊MARCO基因启动子含有1个潜在的活性区域，启动子序列上含有典型的TATA-box元件(图2)，该元件在-14～-9。

图2 绵羊MARCO基因启动子及其活性区域预测

2.2.2 绵羊MARCO基因启动子转录因子预测分析 绵羊MARCO基因启动子的激活需要与转录因子结合。利用软件AliBaba2.1对获得的绵羊MARCO基因启动子预测分析，发现该区域存在多个转录因子作用元件，如GATA-1、GATA-3、Sp1、Oct-1、C/EBPalp、NF-1、NF-κB和c-Jun等转录因子结合位点。其中，出现频率较高的有Sp1、NF-1、NF-κB、C/EBPalp转录因子结合位点(图3)。

图3 绵羊MARCO基因启动子转录因子预测

2.3 绵羊MARCO基因启动子荧光素酶报告载体构建和鉴定

将构建好的pGL3-MARCO荧光素酶报告质粒，利用限制性内切酶NheⅠ和XhoⅠ双酶切后，出现线性化的pGL3-Basic载体条带和绵羊MA-RCO基因启动子条带(图4)，双酶切验证后将质粒交由生物公司进行测序，测序获得序列与预测的一致，说明成功构建了pGL3-MARCO荧光素酶报告质粒，为后续进行基因突变和双荧光素酶活性测定等验证试验奠定了基础。

M.DNA 标准DL 15 000;1.重组质粒pGL3-MARCO双酶切

3 讨论

MARCO作为一种A类清道夫受体，可促进巨噬细胞吞噬细菌从而抵御病原菌的侵入[1,8-10]。猪源MARCO主要高表达于肺组织，绵羊MARCO基因转录水平与之类似[6]。然而，MARCO在绵羊肺组织高表达的机理不明。因此，本试验利用生物信息学方法对克隆的绵羊MARCO基因启动子的特性进行预测和分析，为进一步揭示绵羊体内MARCO基因转录表达调控机理提供基础材料。

本试验克隆的绵羊MARCO基因启动子序列，位于起始密码子上游-1002/-1bp。TATA-box是构成真核生物典型的核心启动子元件之一，在基因转录调控过程中发挥着重要作用[11]。TATA结合蛋白(TATA-binding protein，TBP)识别启动子区域TATA-box并结合RNA聚合酶Ⅱ开始转录。一般认为，组织特异性表达基因均具有TATA-box[12]。本试验发现有1个典型的TATA-box元件，位于绵羊MARCO基因启动子翻译起始密码子上游-14/-9bp，所以推测绵羊MARCO基因为组织特异性表达基因。

转录因子与RNA聚合酶Ⅱ结合形成转录起始复合体从而参与转录起始过程，是基因转录调控过程中的关键调节因子。在绵羊MARCO基因启动子区预测到Sp1、NF-1、NF-κB等多个转录因子结合位点。先前的研究已证实，人源Sp1可以结合Fbxl2(F-box and leucine rich repeat protein 2，Fbxl2)基因启动子激活其高水平表达[15]，Sp1还参与激活HIV-1 LTR(long terminal repeat，LTR)的转录表达[16]。因此，转录因子Sp1在结合促进启动子激活方面发挥重要作用。NF-1参与转录起始复合物的形成，通过与CAAT-box结合调控基因的表达[17]。研究表明[18]转录因子NF-1具有正向调控山羊前黑素小体蛋白(premelanosome protein)基因转录活性的作用。由此可见，Sp1、NF-1 和NF-κB与MARCO基因的表达有潜在联系。

本试验成功克隆了绵羊MARCO基因启动子，并对启动子序列进行了生物信息学分析，进一步构建了绵羊MARCO基因启动子荧光素酶报告基因载体。然而，绵羊MARCO基因启动子是否具有启动子活性、预测的转录因子结合位点是否正确，需进一步验证和深入研究。