不同血清学方法在奶山羊布鲁氏菌病诊断中的比较分析

白 鸽，王国超，陈 茹，庄安宁，王 靖，韦 唯，秦鸽鸽，吴奇强*

(1.渭南市动物疫病预防控制中心，陕西渭南 714000；2.华州区畜牧发展中心，陕西华州 714100；3.蒲城县畜牧发展中心，陕西蒲城 715500)

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种可威胁公共卫生安全和食品安全的严重人兽共患传染病[1]，以发热和流产为主要特征，流行于170多个国家和地区[2]。布病通常是与感染动物密切接触人群的职业病，而近年有报道人的布病通过食源性传播途径感染的比例有上升趋势，布病人群由职业人群向普通人群扩散[3]。渭南市近年来大力发展奶山羊产业，布病作为人兽共患传染病严重威胁公共卫生安全和食品安全，对奶山羊产业健康发展影响巨大，本实验室曾开展畜间布病流行病学调查显示阳性主要集中于羊[4]，开展奶山羊布病监测净化是控制布病流行、维护公共卫生安全和产业健康发展的必要途径，快速、准确并符合基层实际的布病诊断方法对监测净化至关重要。当前，布病实验室检测方法主要分为病原学、分子生物学和血清学，病原学和分子生物学检测方法如病原菌分离培养鉴定、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)等，对实验室仪器设备条件及生物安全等级均有一定要求[5-6]，不适用于基层布病快速检测诊断；血清学检测方法较多，主要包括虎红平板凝集试验(rose bengal plate agglutination test,RBT)、试管凝集试验(serum agglutination test,SAT)、全乳环状试验(milk ring test,MRT)、补体结合试验(complement fixation test,CFT)、荧光偏振试验(fluorescence polarization immunoassay,FPA)、ELISA等，且各有优缺点，在临床检测中，同一份血清样品用不同方法检测，结果不一给检验人员带来了较大困惑[6-8]，适合基层实际工作的检测方法值得研究探讨。本文对RBT、免疫胶体金层析试验(gold immunochromatography assay,GICA)、间接酶联免疫吸附试验(indirect enzyme-linked immunosorbent assay,i-ELISA)、SAT与竞争酶联免疫吸附试验(competitive enzyme-linked immunosorbent assay,c-ELISA)等5种常用检测方法进行比较分析，探讨其特性，为基层奶山羊布病诊断和开展监测净化工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清样本 近2年收集的渭南市辖区内奶山羊养殖场户送检血清479份(根据免疫政策规定未免疫布病疫苗)。

1.1.2 检测试剂 RBT和SAT抗原、标准阳性血清、标准阴性血清,青岛易邦生物工程有限公司产品；GICA检测试剂,上海快灵生物科技有限公司产品；i-ELISA和c-ELISA检测试剂盒,青岛立见生物科技有限公司产品。所有试剂均在有效期内使用。

1.1.3 主要仪器 酶标仪(TECAN-Infinite F50)、自动洗板机(TECAN-HydroSpeed)，瑞士帝肯有限公司产品；生化培养箱(LRH-250F)，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 RBT和SAT试验按照《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T 18646-2018)进行操作和结果判定；GICA、i-ELISA和c-ELISA，按照试剂盒说明书进行操作和结果判定。

1.2.2 评价指标的选择 应用医学统计学方法评价不同检测方法时，待评价方法与参比方法结果比较可形成四格表(表1)。敏感性即灵敏度、真阳性率，值为(A/P1)×100%，反映诊断试验正确判定的能力；特异性即特异度、真阴性率，值为(D/N1)×100%，反映诊断试验能正确排除的能力；假阴性率是指实际错判为阴性的百分比，值为(C/P1)×100%，反映漏诊情况；假阳性率是指实际错判为阳性的百分比，值为(B/N1)×100%，反映误诊情况；符合率即粗一致性，是指待评价方法真阳性和真阴性样本占总样本数的百分比；Kappa一致性检验是考核待评价方法真实性和一致性的方法，Kappa值是一致性检验的统计指标，一般认为，Kappa值≥0.75，说明已经取得相当满意的一致程度，若Kappa值<0.4，则说明一致程度不够理想[9]。

表1 待评价检测方法与参比检测方法检测结果形成的四格表

2 结果

2.1 不同检测方法检测阳性率

用RBT、GICA、i-ELISA、SAT与c-ELISA等5种检测方法对479份奶山羊血清样品进行检测，GICA检出阳性最多，阳性率为10.02%；i-ELISA次之，阳性率为8.35%；SAT检出阳性最少，阳性率为6.26%(表2)。

表2 不同检测方法检测的阳性率

2.2 虎红平板凝集试验与免疫胶体金层析试验、间接酶联免疫吸附试验检测结果比较

RBT与GICA两种方法检测结果比较，RBT检出的36份阳性样品中GICA检出1份阴性，443份阴性样品中检出13份阳性，符合率为97.08%，Kappa值为0.818；RBT与i-ELISA检测结果比较，RBT检出的36份阳性样品中i-ELISA检出1份阴性，443份阴性样品中检出5份阳性，符合率为98.75%，Kappa值为0.914(表3)。

表3 RBT与GICA、i-ELISA检测结果比较

2.3 5种检测方法相关性比较

根据《布鲁氏菌病防治技术规范》(农医发〔2007〕12号)及《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T 18646-2018)要求，SAT为传统的血清学确诊方法，本试验以SAT作为参比检测方法，比较5种方法的相关性。SAT与RBT、GICA、i-ELISA、c-ELISA符合率分别为98.33%、96.24%、97.06%、98.75%；SAT检出的30份阳性样品，用GICA和c-ELISA全部检出，敏感性100%，i-ELISA敏感性最低，为93.33%；SAT检出的449份阴性样品，c-ELISA检出443份，特异性最高，为98.66%，GICA特异性最低，为95.99%；GICA假阳性率最高，为4.01%；i-ELISA假阴性率最高，为6.67%(表4)。

表4 SAT与RBT、GICA、i-ELISA、c-ELISA检测结果相关性比较

利用SPSS 23.0软件对表4中5种方法检测结果进行Kappa一致性检验，结果如表5所示，5种方法Kappa值均大于等于0.75，说明一致性较好。与SAT相比，c-ELISA一致性最好，Kappa值最大，为0.902；i-ELISA一致性最差，Kappa值最小，为0.750。

表5 5种不同检测方法的一致性比较

3 讨论

目前，用于布病检测的血清学检测方法较多，虽然《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T 18646-2018)中规定了相关检测方法，但对检测方法的灵敏度等未进行标准化，诊断试剂不同厂家、不同批次之间敏感性、特异性、符合率等都存在差异，因而存在诊断结果的多样性和不确定性[8，10]。

本文用不同的布病血清学检测方法对同一批奶山羊血清样品进行了同步检测，对检测结果进行了比较分析。从检测结果来看，GICA、i-ELISA与RBT相比，符合率分别为97.08%和98.75%，Kappa值分别为0.818和0.914，符合率和一致性均比较高。SAT与RBT、GICA、i-ELISA、c-ELISA比较，符合率c-ELISA最高，GICA最低，分别为98.75%和96.24%；Kappa值均大于等于0.75，一致性c-ELISA最好，i-ELISA最差，Kappa值分别为0.902和0.750；GICA和c-ELISA敏感性100%，i-ELISA敏感性最低，为93.33%；特异性c-ELISA最高，GICA最低，分别为98.66%和95.99%；GICA假阳性率最高，为4.01%，易出现误诊情况；i-ELISA假阴性率最高，为6.67%，易出现漏诊情况。综上所述，c-ELISA的敏感性、特异性、符合率、假阳性率、假阴性率及Kappa检验一致性均为最好，RBT次之，GICA敏感性高，假阴性率低。

RBT、i-ELISA、SAT和c-ELISA均为GB/T 18646-2018规定的检测方法，通常RBT和i-ELISA用于初筛检测，SAT和c-ELISA用于复核确诊。RBT敏感性高、检测快速、操作简便且成本低，对实验室硬件条件和人员技术要求相对不高，但其结果易受人为主观判断和环境因素影响；i-ELISA敏感性高、样品用量少、高通量适合大批量样本筛查，但成本较高，需要相应的仪器设备和专业技术人员；SAT准确性高、可以半定量、成本低、不需要专业仪器设备，但操作繁琐、耗时长，结果可因主管判断因素影响；c-ELISA敏感性高、准确性好、样品用量少、适合于大批量样本确诊检测，但成本相对较高，需要相应的仪器设备和专业技术人员；GICA虽未列入国标，但敏感性高、检测快速，不需要专业仪器设备，操作和结果判定简便，可用于初筛[11-13]。

因此，基层奶山羊布病监测净化过程中，对于诊断方法的选择要结合布病流行率、人员、经费、实验室条件等实际情况。在低流行率区域大范围开展监测净化工作时，可考虑高敏感性、检测快速、操作简便等方法进行检测，如RBT或GICA；但在高流行率区域监测净化时考虑扑杀成本或在净化评估时，则要综合考虑检测方法的敏感性和特异性，推荐RBT或GICA初筛，c-ELISA复核确诊，通过两种及以上方法联合诊断较为理想。