马子宫内膜炎病原分离鉴定及致病性与耐药性检测

丁渲攀，崔 晓，张西君，达举云，史金莲,张 勇

(甘肃农业大学动物医学院/甘肃省动物生殖生理及繁殖调控重点实验室，甘肃兰州 730070)

马子宫内膜炎是母马常见的疾病之一，其发病率在20%～60%之间[1-3]，不仅会影响母马正常生理功能，还会导致母马繁殖障碍甚至终身不孕，在马场常发疾病中本病被排在第三位(前两位依次为马的呼吸道疾病和马的胃肠道疾病)，对马的养殖会造成较大损害[4-6]。细菌性感染是引起马子宫内膜炎的一个重要原因[7]，目前国内对此病进行相关方面的研究报道较少。因此，本试验通过对马场患子宫内膜炎的母马进行采样，分离纯化病原菌并检测其致病性和耐药性，为马场诊断及治疗此病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 经临床检查患子宫内膜炎的母马,4岁～9岁；SPF小鼠,7周龄～9周龄，体重25 g～30 g。

1.1.2 主要试剂 营养肉汤、DNA提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司产品；革兰氏染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司产品；绵羊血平板，南京森贝伽生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；恒温恒湿培养箱，上海一恒科技有限公司产品；光学显微镜，英菲洛精密科技(苏州)有限公司产品；恒温振荡器，常州国华电器有限公司产品；生物安全柜，苏州赛默飞世尔科技有限公司产品；低温高速离心机，北京艾本德中国有限公司产品；PCR扩增仪、凝胶成像系统，伯乐生命医学产品(上海)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 甘肃某马场，选临床检查为子宫内膜炎的母马，做好保定与清洁工作后，用开宫器配合输精套管插入母马子宫，注入50 mL～100 mL生理盐水然后抽出冲洗液，低温保存。

1.2.2 细菌分离与鉴定 将冲洗液置于离心管内，600 r/min离心15 min，取沉淀在血平板上划线培养细菌并分离纯化3次，挑出单个菌落做革兰氏染色，镜检视野下为相同细菌则进行扩增，营养肉汤扩增后进行细菌16S rRNA测序。用细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA。用细菌16S通用引物进行扩增，PCR体系：20 μL 2×TaqMaster Mix,16 μL ddH2O,上、下游引物各1 μL，2 μL 模板DNA。细菌16S引物序列为F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min;共34个循环，72 ℃延伸5 min。预计片段大小为1 500 bp,PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，在凝胶电泳成像系统中观察。验证扩增条带大小后进行胶回收。胶回收产物送至天启(兰州)生物科技有限公司进行测序。测序结果与NCBI、GenBank 数据库收录序列进行对比分析。

1.2.3 动物试验 参照前期梯度注射试验结果，选取浓度为1×108CFU/mL的病原菌进行动物试验，将35只小鼠随机分为7组，每组各5只。取0.5 mL定量后的细菌营养肉汤培养物，先单独腹腔注射小鼠，验证每种菌的致病性，再将菌液混合后腹腔注射到小鼠，验证混合菌液的致病性，对照组用等量肉汤培养液注射，观察并记录小鼠的生理状况。2 d或死亡后剖检观察小鼠大体病变并采样做回归试验，同时取病变组织，在40 mg/mL甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋切片，HE染色后在400倍光镜下检查。

1.2.4 药敏试验 向比浊管中加入150 μL～200 μL 生理盐水，挑取划线纯化后的单个菌落与生理盐水混合均匀，与0.5比浊度标准管比较，增减生理盐水及细菌量，当浊度一样时即可。将细菌与生理盐水混合液100 μL 加入MHB平板，涂布均匀后贴上常用药敏片。置于恒温恒湿箱中37 ℃ 培养18 h～24 h后观察结果。

2 结果

2.1 病原菌分离结果

对8匹母马样品进行细菌分离后发现有3匹母马呈混合感染，占比为37.5%，5匹为单独感染，占比为62.5%。分离纯化后的细菌在绵羊血平板上分别呈现浅白色(A)、白色(B)、红色(C)、米白色(D)和灰白色透明且溶血(E,F)(图1)。经革兰氏染色后观察，依次为G+杆状细菌(A)，G+双链状细菌(B)，G-单个杆状细菌(C)，G+单个长链或短链状细菌(D)，G+葡萄串状细菌(E)，G+单个或短链状细菌(F)(图2)。细菌DNA的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳显示片段大小为1 500 bp，符合预期大小(图3)。细菌16S rRNA测序后，经GenBack数据库收录序列进行对比分析，结果为芽孢杆菌(A)、肺炎链球菌(B)、大肠埃希氏菌(C)、马链球菌兽疫亚种(D)、葡萄球菌(E)和无乳链球菌(F)。8匹患马中3匹单独感染大肠埃希氏菌；2匹单独感染马链球菌兽疫亚种；1匹为大肠埃希氏菌与马链球菌兽疫亚种混合感染；1匹为大肠埃希氏菌﹑马链球菌兽疫亚种﹑葡萄球菌与肺炎链球菌混合感染；1匹为大肠埃希氏菌﹑葡萄球菌与无乳链球菌混合感染。

A.大肠埃希氏菌；B.葡萄球菌；C.肺炎链球菌；D.无乳链球菌；E、F.马链球菌兽疫亚种

A.芽孢杆菌；B.肺炎链球菌；C.大肠埃希氏菌；D.马链球菌兽疫亚种；E.葡萄球菌；F.无乳链球菌

M.DNA 标准DL 2 000;1.大肠埃希氏菌；2.马链球菌兽疫亚种；3.肺炎链球菌；4.无乳链球菌；5.葡萄球菌

2.2 动物试验结果

病原菌腹腔注射小鼠后，小鼠精神萎靡不振，废饮废食，嗜睡，被毛杂乱，眼部分泌物增加，分别于平均时间16 h(大肠埃希氏菌)、10.5 h(马链球菌兽疫亚种)、18 h(肺炎链球菌)、20 h(无乳链球菌)后死亡，混合菌液于12.5 h后全部死亡。剖检显示，接种马链球菌兽疫亚种小鼠肝脏、肺脏、肾脏和脾脏都有不同程度的充血淤血及肿大。组织切片观察显示肺脏、脾脏、肾脏以及肝脏都有严重出血及淤血，各组织呈不同程度的损伤破碎(图4)。腹腔注射葡萄球菌组小鼠无死亡现象，但剖检见小鼠内脏有充血及渗出。回归试验均分离到攻毒菌(图5)。

A.正常肺;B.病理肺脏;C.正常脾脏;D.病理脾脏;E.正常肾脏;F.病理肾脏;G.正常肝脏;H.病理肝脏

1.病原菌；2.红细胞；3.组织碎片

2.3 药敏试验结果

根据NCCLS标准,药敏试验结果表明分离出的大肠埃希氏菌对四环素耐药、对氨苄西林、头孢哌酮、头孢噻肟等敏感；葡萄球菌对青霉素、氨苄西林耐药、对红霉素、左氧佛沙星、头孢唑林等敏感；肺炎链球菌对青霉素、红霉素、四环素、克拉霉素、头孢唑林、链霉素耐药，对左氧氟沙星敏感；马链球菌兽疫亚种对氨苄西林有一定耐药，对青霉素、红霉素、头孢类以及左氧氟沙星等敏感；无乳链球菌对青霉素、红霉素、万古霉素、氨苄西林、四环素耐药，对氧氟沙星敏感(表1～表5)。

表1 大肠埃希氏菌药敏试验结果

表2 葡萄球菌药敏试验结果

表3 肺炎链球菌药敏试验结果

表4 马链球菌兽疫亚种药敏试验结果

表5 无乳链球菌药敏试验结果

3 讨论

本次对马场患子宫内膜炎母马进行采样及实验室检查后分离出单独感染的2种病原菌是大肠埃希氏菌和马链球菌兽疫亚种，并且混合感染都有这2种菌的参与。结果与Pisello L等[8]的结果相符合。大肠埃希氏菌和马链球菌兽疫亚种是马子宫内膜炎中检出率最高的2种病原菌。在采样方面，目前国际常用的方法有子宫内试子法(US)、细胞学刷子法(CB)、子宫内膜活检法(EB)以及子宫灌洗液法等，子宫灌洗液法在诸多采样方法中有着检出率高、假阳性和假阴性率低、对母畜伤害小等优势[9]。综合考虑个体差异以及不同方法对母畜可能造成的损伤等方面，在诸多方法中选取子宫灌洗液法用于实验室检查。本次检查还分离出了芽孢杆菌、葡萄球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、乳酸杆菌等。与Ricardo M等[10]分离出的结果(大肠埃希氏菌、马链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌、假铜绿单胞菌、肺炎克雷伯氏菌)比较符合，其中分离出有差异的病原菌可能是由于地理位置、养殖环境与方式或品种及个体差异所导致的。经过比对分析，认为此次分离出的菌中，芽孢杆菌和乳酸杆菌非病原菌，故不予开展后续药敏试验等。对其余分离出的菌株致病性的研究中，发现马链球菌兽疫亚种致病性最强，其次为大肠埃希氏菌和肺炎链球菌等，短时间内即可造成小鼠死亡。剖检病死小鼠，经大体解剖以及病理切片发现病原菌感染造成小鼠内脏明显病变，证明分离出的病原菌的致病性十分强大。对于分离出的病原菌进行的药敏试验表明，病原菌已经对某些常用抗菌药物产生了较强的耐药性。但是到目前为止，国内乃至全世界治疗马子宫内膜炎的方法依旧为大量全身性的使用抗菌药物。耐药性的产生对目前马子宫内膜炎的防治构成了严峻的挑战，同时由于本病的病原菌种类与分型多种多样，疫苗的研制遥遥无期，寻找新的方法来预防和治疗本病已经刻不容缓。王德超等[11]进行了中草药方剂对马子宫内膜炎疗效的探究，取得了一定效果。但仍需从发病原因、病理机制以及毒力因子等方面进行系统性的综合研究。

对于本病，仍需贯彻预防大于治疗的方针，加强饲养管理，尤其是产前和产后的护理工作；用人工授精的方式代替自然交配，人工授精时器械应严格消毒，操作得当，注意不要对子宫造成损伤。母马产驹前要更换到干净、卫生、安静的房间，持续关注其生理状况，一旦发生难产、胎衣不下等情况要及时采取措施，防止产后感染。