朱鹮致病性简达气单胞菌的分离鉴定

庆保平，张亚祖，段 英，赵 伟，王兴龙

(1.陕西汉中朱鹮国家级自然保护区管理局，陕西洋县 723300；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

朱鹮(Nipponianippon)是鹈形目(Pelecaniformes)鹮科(Threskiornithidae)朱鹮属(Nippona)的大中型涉禽,属国家一级重点保护野生动物，国际自然保护联盟(IUCN)物种红色名录濒危(EN)物种;濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)附录Ⅰ物种[1-2]。历史上朱鹮曾广泛分布与东亚地区，20世纪中叶以来，朱鹮种群从繁盛迅速衰退，相继在俄罗斯、朝鲜、韩国和日本野外灭绝[3]。1981年，鸟类学家在陕西洋县发现了当时仅存的7只个体，经过40年的有效保护，陕西种群数量已发展到5 275只，占全球朱鹮种群数量的68.67%[4]，但其野生种群仍分布在洋县及其周边市县的狭小区域。

简达气单胞菌(Aeronmnasjandaei)属于气单胞菌科(Aeromonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas)细菌。1991年Carnahan A等[5]首先确定了简达气单胞菌(Aeromnasjandaei)的分类地位。随后，研究表明该菌不仅可感染罗非鱼、暹罗鳄等水生动物，也能感染人和水牛等家畜，是一种人-畜-鱼共患病原菌[6-10]。但尚未见朱鹮等鸟类感染简达气单胞菌的病例的报道。

2020年12月下旬，陕西省洋县清凉水库周边陆续出现多只野生朱鹮死亡。现场收集死亡时间不超过8 h的2具成年朱鹮尸体剖检，采集肝、脾组织分离出2株相同的革兰氏阴性病原菌，经过细菌形态观察、生理生化特征测定和16S rDNA基因序列同源性和聚类分析，确认为简达气单胞菌。人工感染回归试验证实简达气单胞菌为引起朱鹮感染死亡的病原菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样品 无菌采集2只死亡成年朱鹮的肝、肾组织各1份。

1.1.2 主要试剂 琼脂培养基、细菌生化微量鉴定管、药敏纸片,杭州微生物试剂有限公司产品；绵羊血平板，西北农林科技大学动物医学院传染病实验室自制；革兰氏染液，北京索莱宝科技有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；DNA 标准，北京Genstar生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要设备 超净工作台，上海茸研仪器有限公司产品；培养箱，上海沪南科学仪器联营厂产品；摇床，上海能共实业有限公司产品；离心机，长沙英泰仪器有限公司产品；PCR仪，杭州博日科技股份有限公司产品。

1.1.4 实验动物 昆明小鼠9只，体重30 g～35 g,购自空军军医大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 病理剖检 对死亡时间不超过8 h的2具成年朱鹮尸体剖检，进行病理学观察。

1.2.2 细菌分离与培养 无菌操作取病料组织，分别接种普通琼脂平板和绵羊血平板37 ℃培养24 h，观察菌落形态、溶血性等培养特征。挑取形态一致的优势菌落划线培养，获得纯培养菌株。取纯培养菌株单个菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察细菌染色形态特征。

1.2.3 生化试验 挑选纯培养菌株单个菌落，按照细菌生化微量鉴定管使用说明接种培养，观察其反应。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《临床微生物学检验》对其进行菌种鉴定。

1.2.4 16S rDNA PCR鉴定 按照细菌DNA提取试剂盒所述方法提取分离菌DNA。采用细菌16S rDNA通用引物进行扩增。PCR产物经胶回收试剂盒纯化后送西安擎科泽西生物科技有限公司进行测序。将测序结果在NCBI中进行Blast比对，选取同源性相近的序列，应用MEGA7.0软件对选取的序列进行同源性分析及进化树构建。

1.2.5 致病性试验 挑取纯培养菌株单个菌落，在LB液体培养基，37 ℃、220 r/min摇床培养，至OD 600 nm值为0.3左右时，PBS调整菌液浓度为1.05×1011CFU/mL。将9只试验小鼠随机分为3组，每组3只，按照1.0×1010CFU/只和1.0×108CFU/只的量分别腹腔接种试验组小鼠，对照组小鼠腹腔接种0.5 mL灭菌生理盐水。接种后，各组小鼠分笼饲养，每天记录小鼠的临床表现和发病、死亡情况。

1.2.6 药敏试验 采用药敏纸片扩散法(KB法)，取浓度1.0×108CFU/mL的菌液100 μL均匀涂布于MH琼脂培养基上,将药敏纸片贴在培养基表面，37 ℃培养24 h后，测定抑菌圈直径，根据CLSI的标准判读试验结果。

2 结果

2.1 病理变化

死亡朱鹮剖检可见主要病变为肺部淤血、肝脏肿胀、胰脏点状出血，腺胃和肌胃充盈，胃内容物为鱼类，肠道弥散性出血等。

2.2 细菌的形态特征

分离菌在普通琼脂培养基上生长良好，形成乳白色、圆形、微隆起，表面光滑、边缘整齐、半透明的中等大小菌落。在绵羊血平板上生长良好，呈明显的β溶血，培养48 h后呈灰白色、扁平状大菌落。细菌革兰氏染色阴性，多数菌体短小，无芽孢，多为单个排列，部分呈现短丝状排列(图1)。

A.普通琼脂平板;B.血琼脂平板;C.革兰氏染色

2.3 生化培养特性

分离菌株精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、氧化酶和接触酶呈阳性;鸟氨酸脱羧酶呈阴性；葡萄糖、麦芽糖、甘露糖呈阳性;庶糖、乳糖、阿拉伯糖、纤维二糖、七叶苷、肌醇、水杨苷呈阴性;靛基质试验阳性,VP试验阳性(表1)。分离菌生化特性与《伯杰氏鉴定细菌学手册》和《临床微生物学检验》所提供的标准菌株的生理生化特性与简达气单胞菌基本一致。

表1 分离菌株的生化培养特征

2.4 16S rDNA PCR鉴定结果

分离菌株16S rDNA的PCR检测，产物经琼脂糖凝胶电泳，可见1 500 bp左右的特异性条带(图2)。

M.DNA 标准DL 2 000;-.阴性对照；1、2.分离菌

PCR产物送西安擎科泽西生物科技有限公司进行测序。将所测得的基因序列与GenBank数据库中已有的序列进行对比，分离菌与气单胞菌属(Aeromonas)细菌的同源性为100%。将获得序列与GenBank数据库中的气单胞菌基因序列进行系统进化分析，(Mega7，Maximum Likelihood Tree)，分离菌株(ZXQb3)，在种上与JX426061.1:50-1373Aeromonasjandaeistrain HME8596菌株汇为一支(图3)，表明其亲缘关系较近，同源性为99%。结合该菌株的形态特征、生化反应特点等，确定分离菌为简达气单胞菌。

图3 分离菌16S rDAN序列系统发育树

2.5 致病性试验结果

接种细菌的小鼠出现精神沉郁、被毛凌乱、食欲降低症状。24 h内高剂量感染小鼠死亡2只(2/3)，低剂量感染小鼠无死亡；48 h内高剂量感染小鼠全部死亡，低剂量感染小鼠死亡1只；对照组小鼠精神状态良好,食欲正常。

剖检小鼠发现小鼠肠道胀气，腹腔有恶臭腐烂气味，肝脏发黑，肺脏出血。取肝脏、肺脏、脾脏接种绵羊血平板再次分离培养细菌，获得形态和生理生化特征与朱鹮脏器分离菌特征一致的菌株。

2.6 药敏试验

病原菌对10种抗菌药物的药敏试验结果表明，细菌对丁胺卡那霉素、氟哌酸、氯霉素、复方新诺明4种药物高度敏感;对庆大霉素、红霉素2种药物中度敏感;对青霉素、氨苄青霉素、头孢唑林(先锋Ⅴ)3种药物产生耐药性。

3 讨论

为排除禽流感和新城疫等重大动物疫病疫情的可能，样品采集前，分别取口咽和肛门拭子，按照国家禽流感和新城疫诊断技术标准进行了禽流感和新城疫的诊断，结果均为阴性。在确定排除重大疫情的前提下开展了上述试验研究。

根据分离菌株的形态特征、培养特性和生化试验结果，结合16S rDNA PCR鉴定结果,确认该菌株为简达气单胞菌。动物感染试验中高剂量人工感染小鼠病程短且病死率高，其临床症状和肝脏、肺脏及消化道病理变化与死亡朱鹮表现趋于一致，从死亡小鼠体内重新分离到与死亡朱鹮内脏组织中分离菌相同的菌株，因此可以认为简达气单胞菌是引起朱鹮死亡的致病性病原菌。

多年来，人们对朱鹮疾病的研究多集中在人工饲养种群，目前报道的朱鹮细菌性疾病的病源菌主要有大肠埃希氏菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌等[11-13]。野生朱鹮常年在河流、水田、塘库、滩涂等湿地中觅食，鱼、虾、蟹、螺和水生昆虫是其主要的食物来源，水和食物的安全关乎朱鹮的健康。简达气单胞菌等气单胞菌属细菌存在于水生环境和水生动物体内，邓玉婷等[14]、胡萌[15]分别在广东和江苏省部分水产养殖地区水体中检测到简达气单胞菌。温贵兰等[16]、龙苏等[17]、杨文飞等[18]分别从患病的彩鲤、禾花鲤和黄颡鱼体内分离到简达气单胞菌，并对其致病性进行了研究。可见简达气单胞菌是一种分布广泛，可致使多种水生生物，尤其是鱼类感染的致病菌。本研究样本采集地清凉水库是野生朱鹮的一处觅食地和夜宿地，多年来一直有朱鹮在此觅食和夜宿。事发时调查发现，该水库因水体污染严重，水边漂浮着许多死亡的鲤鱼、鲫鱼和小杂鱼，结合朱鹮死亡环境和死亡个体胃内充满大量鱼刺、鱼骨的现象，怀疑朱鹮的死亡与取食简达气单胞菌感染的鱼类有关，具体情况有待进一步研究。

本研究是对野生朱鹮感染简达气单胞菌引起死亡的首次报道，希望引起保护部门对野生朱鹮疾病和取食环境的关注，从而加强野生朱鹮管理，使其远离污染水域、防止取食腐败变质食物，确保朱鹮安全。试验中药敏试验结果为本次朱鹮疾病的防治提供了一定依据，可以为该病的研究和综合防治提供参考。