内质网应激在抗病毒天然免疫应答中的研究进展

李 正，方 钱综述，陈涛涌审校

0 引 言

天然免疫系统是机体抵御病原微生物入侵的第一道防线。机体通过模式识别受体识别病原相关分子模式或损伤相关分子模式启动天然免疫应答。2019年末爆发的新型冠状病毒肺炎疫情，提示我们病毒的存在仍然会对人类健康及社会稳定造成极大影响[1]。病毒感染后，机体可通过模式识别受体识别病毒的核酸及其他模式分子并立即启动天然免疫应答，激活相关信号转导通路，诱导干扰素以及炎性细胞因子的产生，从而发挥抗病毒效应，清除病毒感染并修复组织损伤。然而，由于病毒的自身理化特性、基因突变、繁殖速度快等因素，病毒感染通常复杂且迅速，天然免疫系统往往需要多种机制参与才能保证有效地识别、清除病毒。

内质网参与调控包括蛋白质折叠、翻译后修饰、钙储存和脂质膜生物合成等在内的多种功能，其稳态对于维持细胞内环境的稳定、细胞正常的生理功能至关重要。在病毒感染过程中，病毒可利用宿主细胞内质网合成其生命周期所需蛋白，从而完成病毒入侵、蛋白合成折叠与修饰、基因组复制以及病毒组装与释放等过程[2]。尽管内质网受到各种机制的精密调控，但病毒的活动在某些情况下将诱导内质网应激的发生[3]。内质网应激发生后，为保持蛋白质合成的保真度，维持内质网的正常生理功能，真核细胞主要通过激活未折叠蛋白反应(Unfolded protein response，UPR)来纠正内质网应激的状态[4]。虽然UPR是细胞应对内质网应激的一种方式，但已有众多研究表明，UPR从多个水平参与了天然免疫反应，如直接防御微生物病原体、抗原呈递、调控促炎细胞因子的产生、维持代谢稳态和免疫耐受、参与免疫原性细胞死亡等[5]。近些年来，内质网应激在抗病毒天然免疫中发挥的作用逐渐被揭示。病毒感染后造成的内质网应激将通过多种通路的活化调节天然免疫系统，进而对病毒的复制、致病性等造成显著影响。本文就内质网应激活化UPR信号转导、病毒感染诱导内质网应激、UPR响应病毒感染、内质网应激参与抗病毒天然免疫等方面作一综述。

1 内质网应激活化UPR信号通路

内质网应激是指内质网在蛋白稳态网络失调时所诱发的一种应激反应。多种生理压力和环境波动均可能破坏内质网功能从而导致内质网应激的发生。例如，某些外部因素，如细胞缺氧、pH值过低、氧化脂质暴露、营养缺乏等微环境改变，以及在肿瘤治疗过程中应用细胞毒性药物、放射性物质等，或某些细胞内部因素，如高代谢需求、活性氧聚集、细胞分化或明显偏离代谢调定点等，均可能造成细胞蛋白稳态调节网络失衡，进而导致未折叠或错误折叠的蛋白在内质网大量蓄积，触发内质网应激[5-6]。

为抵抗内质网中异常蛋白质的过度蓄积，机体可通过UPR缓解内质网应激。UPR是一种进化上保守的应激反应，将从基因转录、蛋白翻译和修饰等多个层面进行调控，以减轻未折叠或错误折叠蛋白的负荷，恢复内质网蛋白合成的稳态。然而，当内质网应激无法缓解或过强时，细胞将无法恢复内质网正常生理状态，并将启动细胞内源性的凋亡程序，导致细胞死亡[7-8]。

UPR主要由肌醇酶1α(Inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)、PKR样内质网激酶(PKR-like ER-resident kinase，PERK)和激活转录因子6α(Activating transcription factor 6α，ATF6α)三种定位于内质网的跨膜蛋白驱动，这三种蛋白共同发挥感受内质网应激信号的作用。在细胞稳定状态下，这三种跨膜蛋白的腔内结构域被热休克蛋白70分子伴侣BiP(HSP70-type chaperone binding-immunoglobulin protein)所结合，并处于失活状态[9]。由于BiP对错误折叠的蛋白质的亲和力比三种跨膜蛋白高，当内质网应激发生时，BiP将与以上三种跨膜蛋白解离，进一步诱导下游信号转导反应。

1.1IRE1α-XBP1s通路IRE1α信号通路是UPR中最为保守的一条通路。BiP从IRE1α的内质网腔内域解离之后，IRE1α发生寡聚化以及自发磷酸化，诱发IRE1α构象的改变，从而激活其C端RNA酶活性。在胞质中，IRE1α通过剪切转录因子X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP-1)mRNA，从而编码产生剪切型的XBP-1s蛋白。XBP-1s蛋白促进内质网形态上的扩张，并可上调蛋白折叠相关基因的表达，从而缓解内质网应激[10]。近些年随着研究的不断深入，XBP-1s蛋白参与调控的范围不断拓展，在包括脂质代谢、炎性细胞因子、HIF1-α缺氧反应以及细胞分化等多个领域发挥了重要作用[5]。此外，IRE1α也可通过可调控的IRE1α依赖衰减途径(regulated IRE1α-dependent decay，RIDD)降解内质网定位的mRNA，从而限制蛋白质的翻译[11]。

1.2PERK-eIF2α-CHOP通路PERK是一种内质网定位的跨膜蛋白，同时也是4种已知的真核翻译起始因子2α(translational initiation factor 2α in eukaryotes，eIF2α)蛋白激酶之一。在BiP解离后，PERK可同样发生寡聚化及自发磷酸化，显著增强由PERK所介导的翻译抑制，并大幅诱导蛋白稳态相关介质的产生。PERK可通过磷酸化eIF2α，抑制5′端帽依赖的蛋白翻译过程[12]，从而广泛抑制蛋白合成。但近期的研究表明，eIF2α磷酸化引发的蛋白下调并不一致。其中，稳定性高的蛋白翻译下调得更加持久，而寿命短、稳定性差的蛋白则下调得相对较弱[13]。此外，磷酸化的eIF2α在抑制蛋白翻译的同时，导致5′端含有短开放阅读框的mRNA翻译增强，从而促进激活转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)的表达[14]。ATF4随后促进转录因子C/EBPα-同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)以及GADD34的产生。其中，CHOP参与调节自噬、氨基酸代谢、抗氧化反应和细胞死亡等生理过程，而GADD34则通过去磷酸化eIF2α负向调节PERK通路[15]。

1.3ATF6α通路ATF6α是一种以胞质N端bZIP转录因子为特征的内质网跨膜蛋白。不同于PERK和IRE1α，BiP解离后ATF6α转移至高尔基体，在高尔基体近膜位点常驻蛋白酶(S1P和S2P)的作用下，ATF6α蛋白水解释放N-末端结构域，进入细胞核并作为转录因子促进分子伴侣、内质网相关降解(ER-associated degradation，ERAD)复合体的形成，并调控蛋白的折叠和降解[16]。

1.4UPR信号通路的协作在内质网应激发生时，UPR三条信号通路相互协调，以最大限度地提高细胞的适应性。其中，XBP-1和ATF6α通过上调伴侣蛋白、糖基化酶、内质网相关降解成分、细胞内转运机制和蛋白质二硫化物异构酶等来增强内质网蛋白质的折叠能力[17]。IRE1α通过降解内质网定位的mRNA限制蛋白质的内质网内流。PERK下调蛋白质合成反应，从而使得内质网有充分时间纠正蛋白质的错误折叠。此外，值得注意的是，在致死性内质网应激状态下，IRE1α通路逐渐关闭，而PERK持续激活，这表明UPR三条通路的选择性激活对于调节细胞适应和存活同样至关重要[18-20]。

由此可看出，UPR是一个由三条通路组成的复杂反应网络，三条通路相互配合，共同缓解细胞的内质网应激状态。但另一方面，在内质网应激过强、持续时间过长或超过细胞自身调节能力时，UPR将导致细胞凋亡等效应。

2 病毒感染诱发内质网应激

2.1 诱导内质网应激的病毒及其特征首先，诱导内质网应激的病毒具有致病性或毒性。同一类型病毒毒株，其无毒毒株或减毒毒株，如非细胞病变的轻度杜贝病毒[21]，不触发或仅触发轻微的内质网应激，提示内质网应激与病毒的毒性和致病力密切相关。其次，利用宿主内质网作为其糖蛋白合成、基因组复制和病毒颗粒组装场所的病毒，如非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，ASFV)[22]和SARS病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)[23]，倾向于触发内质网应激。此外，能够通过调控内质网增殖与形态以塑造适宜病毒复制场所的病毒易于诱发内质网应激，如水痘-带状疱疹病毒能够刺激内质网增殖[24]、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)能够改变内质网结构从而触发内质网应激[25]。最后，在内质网中合成、加工并定位于内质网的病毒蛋白如猪流行性腹泻病毒E/N蛋白[26]，易于诱发内质网应激。

2.2病毒诱发内质网应激的机制在病毒感染后的复制周期中，病毒利用宿主细胞内质网产生大量的病毒蛋白。这些大量合成的蛋白超过了内质网的折叠能力，从而导致内质网应激的发生[27]。另一方面，病毒蛋白如人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)的 US11 蛋白、登革病毒E蛋白等，通过与内质网定位分子伴侣BiP等相互作用，促进病毒蛋白的折叠与复制，促进病毒增殖，进而诱发内质网应激[28]。此外，病毒感染所诱导的促炎细胞因子以及干扰素等的大量合成，如TNFα、IL-1β、IL-6以及IFN-γ等，同样可能诱导内质网应激[29]。然而，目前大多数病毒触发内质网应激的具体机制仍未完全阐明，病毒蛋白在内质网腔内快速合成与堆积导致蛋白质合成压力的增加、感染诱发的免疫炎症反应、病毒复制对内质网膜的干扰以及病毒蛋白与内质网内分子伴侣蛋白BiP等的相互作用等，可能解释病毒感染造成的内质网应激。此外，鉴于UPR广泛存在于免疫炎症反应的多个阶段，组织环境等因素在病毒感染期间是否触发内质网应激需要进一步阐明。

3 UPR响应病毒感染

3.1 病毒感染造成内质网应激并激活UPR病毒感染造成的内质网应激发生后，细胞可通过诱导UPR缓解内质网应激。研究表明，在不同病毒感染情况下，UPR活化的通路有所不同，其中PERK-eIF2α通路在病毒感染时能够被更广泛地激活[29]。但有研究发现，西尼罗河病毒(West Nile Virus, WNV)在感染过程中更倾向于诱导ATF6α以及IRE1α，且具有高水平XBP1激活的表现，而eIF2α磷酸化及其下游信号通路转录几乎不受影响[30]。此外，ASFV单独诱导ATF6α通路的激活[22]。由此可看出，病毒诱导的UPR通路相差较大，多数病毒能够激活UPR全部三条通路，但有些仅可活化其中一条。到目前为止，病毒选择性激活UPR通路的机制尚未完全阐明，病毒自身结构、蛋白组成成分以及其在宿主细胞内的生存方式等因素均可能对UPR通路的活化产生影响。

3.2UPR影响病毒复制UPR在抑制内质网的蛋白质合成、增加蛋白质的折叠能力、促进内质网相关蛋白降解的同时，可能对病毒的复制产生影响[31]。有研究指出，毒胡萝卜素(Thapsigargin)能够诱导UPR上调，促进IRE1α通路活化抑制包括新型冠状病毒(SARS-CoV-2)在内的多种冠状病毒复制减弱[32]。PERK-eIF2α通路介导的整体蛋白翻译减缓(包括病毒蛋白)能够作为抗病毒机制从而限制WNV的复制[30]。IRE1α-XBP1通路介导的ERAD途径降解乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus，HBV)包膜蛋白从而减少胞内病毒颗粒的累积[33]。在呼吸合胞病毒感染时，IRE1α通过RIDD降解病毒RNA从而阻断病毒复制[34]。

值得一提的是，UPR在某些情况下也可能造成病毒复制的增强。其中，ATF6α可通过诱导内质网伴侣蛋白的表达协助病毒蛋白折叠，ATF4能够协助细胞代谢重建并恢复蛋白翻译，IRE1α-XBP1通路可通过增强蛋白折叠能力以及内质网膜的生物合成从而促进病毒复制。研究表明，活化的ATF6能够促进ASFV的复制[22]，寨卡病毒感染则激活的IRE1α-XBP1通路可促进其自身的复制[35]。上述结果说明，在病毒感染后导致的内质网应激过程中，UPR对于病毒复制起着双重作用，而UPR在病毒感染时具体发挥何种效应可能取决于所感染的病毒种类、病毒荷载量以及宿主细胞特异性等。

3.3病毒调控UPR以促进自身复制虽然UPR能够影响病毒复制，但病毒为了在宿主细胞中存活和增殖，可通过对UPR进行调控，将内质网应激限制在有利于病毒复制的水平，从而避免被细胞的自我保护机制所损害。

HCV亚基因组复制子和HCMV能够通过抑制XBP1s的转录活性，负向调控IRE1α-XBP1通路，从而增强病毒蛋白的合成，维持病毒的感染[36]。在单纯疱疹病毒1(herpes virus 1，HSV-1)感染期间，HSV-1的UL1蛋白通过减少XBP1的mRNA累积，从而降低XBP1的表达并能够抑制XBP1剪切活化[37]。而日本脑炎病毒则可利用RIDD来降解宿主RNA而不影响病毒本身RNA[38]。此外，某些病毒能够根据自身需要，重置细胞的翻译程序，逃避PERK-eIF2α通路介导的抑制效应。如基孔肯雅病毒能够通过上调p58IPK的转录从而抑制PERK的活性[39]，从而逃逸PERK-IRE1α通路的影响。

较为特殊的是，某些病毒可直接控制宿主蛋白的产生从而对内质网应激进行调控。如甲型流感病毒通过表达其非结构蛋白NS1干扰宿主信使RNA加工因子CPSF30，并抑制内质网应激反应因子XBP1等，限制宿主蛋白的产生以缓解内质网应激，促进病毒复制[40]。

由此可见，病毒感染全面或选择性激活的UPR将从两个方面响应病毒感染。一方面UPR通过影响病毒蛋白的合成促进或抑制病毒复制，另一方面病毒也能够通过对UPR的调控，避免被宿主细胞清除，促进自身复制。

4 内质网应激参与抗病毒天然免疫反应

机体免疫系统在识别病毒入侵后，通过诱导信号级联反应并激活相应的转录因子，激活下游效应。研究表明，病毒感染诱导的内质网应激发生与促炎细胞因子和I型干扰素的产生密切相关。内质网应激通过诱导UPR的发生参与调控抗病毒天然免疫反应的各个环节，从而对病毒的致病性产生影响。

4.1UPR增强抗病毒天然免疫反应病毒感染宿主细胞后被模式识别受体所识别，并激活宿主的天然免疫应答。在此过程中，UPR可作为细胞内的“危险”信号提醒病毒入侵并增强抗病毒免疫反应，促进炎性细胞因子和I型干扰素的产生。

HCV感染后激活IRE1α并进一步诱导活化TRAF2-JNK通路，从而促进炎性介质表达，诱导肝脏细胞的炎症反应[41]。So等[42]发现IRE1α通过XBP-1介导了应激诱导的抗病毒IKK相关激酶的上调，进而增强抗病毒免疫应答强度。Cho等[43]的研究表明，HBV合成的X蛋白通过PERK-eIF2α通路活化ATF4，诱导环加氧酶2的表达，进而增强肝细胞炎症反应。传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)能够激活PERK-eIF2α信号通路，诱导蛋白质翻译的整体衰减，这一效应除直接抑制病毒产生外，还导致了IκBα水平显着降低并增强了NF-κB活化,促进I型干扰素的产生，从而负性调控病毒复制[44]。SARS-CoV-2感染能显著刺激NF-κB蛋白的表达，进一步研究显示，其活化与IRE1α的表达增加密切相关，表明病毒感染诱导的内质网应激反应可能促进了宿主细胞的炎性环境[45]。此外，同型半胱氨酸诱导的内质网蛋白(homocysteine-induced ER Protein, HERP)在内质网应激时由UPR诱导表达。在RNA病毒感染过程中HERP表达上调，通过与TANK结合激酶1相互作用，放大 MAVS信号并促进IFN调节因子3和NF-κB的磷酸化和核转位，增强I型干扰素的表达，从而抑制RNA病毒的复制[46]。以上研究均表明在病毒感染过程中，UPR增强抗病毒免疫应答、促进免疫炎性细胞因子上调，限制病毒复制，进而对病毒感染造成显著影响。

4.2UPR抑制抗病毒天然免疫反应内质网应激还可通过诱导UPR的发生，抑制抗病毒天然免疫应答，进而造成病毒的免疫逃逸。水疱性口炎病毒和HCV可通过激活PERK-CHOP通路，诱导IFNAR1磷酸化依赖的泛素化，并导致其降解，抑制I型干扰素通路和抗病毒天然免疫强度，从而促进病毒的免疫逃逸，增加病毒的致病力[47-48]。HCMV合成的US11蛋白激活UPR从而促进MHC-I类分子的降解，造成免疫逃逸，从而导致慢性感染的发生[49]。此外，HCV还可通过CHOP和随后的自噬激活拮抗IFN-β的产生，从而抑制抗病毒天然免疫反应[50]。WNV感染能够诱导内质网应激并通过ATF6通路的活化促进细胞存活，抑制I型干扰素信号通路，从而促进WNV的免疫逃逸及复制[30,51]。这说明，UPR在抗病毒天然免疫应答中的效应同样是双重的。但病毒所触发的内质网应激反应如何在细胞促炎和抑炎效应之间平衡仍有诸多未知因素，病毒自身特性、细胞的异质性、免疫细胞状态以及UPR活化的强度可能是内质网应激诱导抗病毒免疫反应活化的重要因素。

4.3抗病毒天然免疫应答反馈调节内质网应激及UPR在病毒感染所导致的抗病毒天然免疫应答过程中，抗病毒效应分子的表达能够反馈性地对内质网应激产生影响，进而对病毒感染产生调控作用。在HBV病毒感染的肝细胞中，HBsAg的积累诱导了肝细胞内质网应激的发生，而干扰素与慢性HBV感染期间的肝损伤密切相关[52]。Baudi等[53]的研究发现，IFNα能够抑制HBV感染肝脏细胞的UPR，进而导致内质网应激相关细胞死亡的发生。而通过抑制GRP78或使用低剂量衣霉素诱导UPR上调，可以减缓IFNα介导的肝损伤。此外，有研究显示，在HCV感染肝脏细胞后，IFNλ4在内质网中大量聚集诱导内质网应激的发生。内质网应激发生后，MHC-I复合物对HCV抗原肽的加载和表面呈递能力将受到显著影响，造成HCV特异性的T细胞反应减弱，从而有利于病毒的免疫逃逸[54]。

由此可见，在抗病毒免疫应答发生后，免疫炎性细胞因子等的表达能够反馈性作用于抗病毒免疫的效应，而内质网应激所诱导的UPR在其中发挥了关键作用。

5 结语与展望

内质网应激通过触发UPR抑制蛋白质合成、降解相关蛋白从而抑制病毒复制，并增强天然免疫以及炎性反应强度，对病毒复制、荷载以及致病性发挥影响。另一方面，UPR增加内质网蛋白质的折叠能力、协助细胞蛋白翻译也可促进病毒复制，并通过其中某些环节削弱抗病毒天然免疫应答以及炎性反应。与此同时，病毒在长期的进化过程中也发展出了调控UPR的不同机制，进而造成免疫逃逸，促进自身的繁殖。这些均提示我们内质网应激可能在抗病毒天然免疫中发挥着关键作用。然而，由于内质网应激在病毒复制、致病过程中的作用广泛而复杂，目前病毒感染与内质网应激间相互作用的具体机制尚未被完全阐明。对于大多数病毒蛋白而言，还不清楚究竟是哪些特殊的修饰方式、结构与内质网应激的发生有关。此外，病毒感染后造成的内质网应激是否会造成天然免疫细胞识别功能的紊乱等，都有待于我们更加深入地探索。而通过这些努力，终将会为我们找到行之有效的抗病毒策略提供帮助。