铁死亡与骨骼以及关节疾病的研究进展

杨延辑,谭先昱综述,廖文波审校

0 引 言

程序性细胞死亡是由细胞内特定基因调控的分子程序介导的的细胞死亡过程，在生物体生命活动中发生至关重要作用[1]。铁死亡(Ferroptosis)是一种新的程序性细胞死亡类型，其发生与铁依赖相关，以细胞内脂质活性氧的堆积为特征的细胞死亡[2]。已证实其与许多疾病相关[3]，如脑卒中、缺血再灌注损伤、神经退行性疾病、肿瘤等[4]，且系目前研究热点[5]。近年发现铁死亡与许多骨科疾病进程中扮演重要作用，本文就铁死亡在骨骼、关节疾病中相关研究进行综述,旨在为临床防治和研究提供新的依据。

1 铁死亡的概念

自然界生物体中铁是重要的微量元素，在细胞生长及增殖、氧的运输和储存，氧化代谢等有重要作用。此前的研究发现抗肿瘤药Erastin拥有诱导Ras突变细胞死亡的能力，且与当时已知的细胞死亡方式不同，没有明显的细胞凋亡相关特征，进一步研究发现谷胱甘肽过氧化物酶 4(glutathione peroxidase 4，GXP4)抑制剂Ras选择性致死小分子(Ras-selective lethnal compound，RSL3)可诱导类似细胞死亡，而铁螯合剂可以抑制这一过程，这种新型死亡方式与活性氧(reactive oxygen species,ROS)及细胞内铁相关[6-8]。铁死亡主要形态特征变化发生在线粒体，表现为线粒体缩小，脊减少甚至消失, 膜密度增高,细胞膜崩解，而生物学特征主要是谷胱甘肽(glutathione,GSH)消耗、GXP4失活，导致ROS和铁的异常积蓄，诱导细胞死亡。2012年Dixon等[9]正式的将这一新型的与铁依赖相关死亡方式命名为铁死亡。

2 铁死亡发生机制

铁死亡是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬等新型的细胞程序性死亡方式。铁死亡的发生涉及铁的代谢异常，活性氧的堆积，脂质的代谢等。

2.1铁代谢铁作为重要微量元素参与多项重要的生理活动如氧的运输，血红蛋白的合成等[10]。由于人体缺乏有效的排除铁的途径，过量铁的摄，基因突变，衰老等因素都可以导致机体出现铁超载。许多疾病的病理状况与铁离子过量或代谢异常相关[11]，如铁离子的超载会增加关节疾病[12]、神经退行性疾病[13]等患病风险。研究证实，在发生铁死亡的细胞内铁离子水平明显增加[14]，故认为铁离子的异常积蓄是铁死亡的重要标志之一。正常生理状态下，铁以Fe3+和Fe2+的形式存在，体内Fe2+被氧化为Fe3+,进而与转铁蛋白形成复合物，在铁还原酶作用下还原为 Fe2+从而维持铁稳态。过量的铁可以通过芬顿(Fenton) 或哈伯 · 韦斯(Haber Weiss)反应产生ROS堆积，启动脂质过氧化，诱导铁死亡的发生[15]。

2.2脂质过氧化ROS及脂质过氧化物的异常积蓄是诱导发铁死亡的重要因素之一。ROS的异常积蓄会使GSH被消耗，GPX4活性降低[16]，而GPX4是目前已知的唯一用于脂质体过氧化物还原的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)，在铁死亡的发生中扮演关键作用。多化合物诱导铁死亡的发生，各自的信号通路也各不相同，但最终结果都是使GPX活性降低，增加脂质过氧化反应，导致铁死亡的发生，故而认为GPX4 是铁死亡的关键调节因子[17]。目前研究铁死亡的发生机制主要是两条，分别是抑制GPX4和抑制胱氨酸/谷氨酸逆向转运受体(the cystine/glutamate antiporter system，systemXc-)的活性。RSL3与Erastin都是铁死亡诱导剂，其中RSL3是一种GPX4抑制剂，直接抑制GPX4使其失活，导致ROS的大量积蓄，最终诱细胞导铁死亡，另二苯基氯化碘盐7(diphenyleneiodonium chloride 7，DPI7)、二苯基氯化碘盐10(diphenyleneiodonium chloride 10，DPI10)等也有类似作用[8-17]；而Erastin被证实是一种 systemXc-抑制剂[9-18],主要通过抑制 systemXc- 介导的胱氨酸摄取，降低GSH的含量从而损害细胞的抗氧化防御，促进 ROS 的累积，进而促进铁死亡的发生[19]。柳氮磺吡啶(Sulfasalazine,SAS)不仅可以抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运体,而且还会影响胱氨酸依赖的GSH 的合成,从而导致铁死亡的发生[20]。

3 铁死亡与骨骼、关节疾病

3.1 骨性关节炎骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是由多种因素引起慢性退行性疾病，膝骨关节炎已成为世界残疾的第四大原因[21]。越来越多的研究发现铁超载与OA相关[22]，并且认为铁代谢异常是OA发展的危险因素之一[23]。OA患者关节滑液中铁浓度明显的高于健康者[24],关节损伤程度与血清铁蛋白的升高程正相关[25]。通过建立铁过载并手术诱导OA小鼠模型，结果发现铁超载引起了含凝血酶敏感素基序的去整合素金属蛋白酶5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS5)、是基质金属蛋白酶13(matrix metal- lopmteinase 13，MMP13)高表达和更严重的软骨破坏，二价金属离子转运体( divalent metal transporter 1，DMT1)在铁超载诱导的 OA 进展中起关键作用[26]。白细胞介素(interleukin-1β, IL-1β) 和枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate, FAC) 都诱导了关节软骨ROS 异常积蓄，导致软骨细胞死亡，而铁死亡诱导剂Erastin可上调软骨中MMP13的表达，下调软骨细胞中 II 型胶原蛋白的表达；向OA小鼠模型关节内注射铁死亡抑制剂(ferrostatin-1)后发现上调了II 型胶原蛋白的表达，并且延缓了OA的发展[27]。此外，有学者发现D-甘露糖可以通过减弱软骨细胞对铁死亡的敏感性从而发挥保护软骨，减轻 OA 进展的作用[28]。滑膜炎是OA的重要病理过程，被证实与铁死亡相关，有学者利用脂多糖处理滑膜细胞构建滑膜炎细胞模型，发现滑膜细胞中铁含量及MDA增加，溶质载体家族成员3成员2(solute Carrier Family 3 Member 2 ,SLC3A2L)、溶质载体家族成员7成员11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)和GPX4水平下降，而淫羊藿苷可以降低铁含量，并且抑制铁死亡[29]。目前认为细胞内铁代谢异常引起大量的铁积蓄参与滑膜改变、软骨退变和软骨下骨重塑的病理过程。滑膜炎导致滑膜增生和血管生成并且还促进软骨细胞铁死亡，此外，还会导致破骨细胞的增殖和活性增加，并抑制成骨细胞的功能和增殖，导致软骨下骨重塑[30]。

3.2骨肉瘤骨肉瘤是儿童和青少年中最常发的恶性骨肿瘤，临床上主要采取化疗及手术的方式。研究发现铁死亡在肿瘤的发展及免疫等方面发挥重要作用[31-32]。Luo等[33]发现补骨脂甲素(bavachin)可以诱导骨肉瘤细胞死亡，并且因基质金属蛋白酶(matrix metal- lopmteinase ，MMP)降低导致线粒体出现典型的铁死亡形态特征变化，增加转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFRC) 和 DMT1 表达同时降低铁蛋白重链(ferritin heavy chain，FTH) 和 铁蛋白轻链(ferritin light chain ，FTL) 表达使得细胞内亚铁水平增高，此外，bavachin通过下调磷酸化信号转导和转录激活因子3(phosphorylated-signal transducers and ac-tivators of transcription 3,p-STAT3)、上调P53表达导致 SLC7A11 和 GPX4 表达降低并促进 ROS 和 脂质过氧化物丙二醛(Malonaldehyde, MDA )积累，诱导铁死亡的发生，而通过铁死亡抑制剂可以抑制这一过程。替拉扎明(Tirapazamine，TPZ)为新型生物还原剂类抗肿瘤药，其主要作用在乏氧细胞内代谢产生自由基导致DNA损伤和细胞死亡。Shi等[34]研究发现TPZ可以有效的抑制骨肉瘤的增殖和转移，通过测定骨肉瘤细胞里相关铁蛋白的水平， 证实缺氧条件下TPZ导致SLC7A11和GPX4等关键铁死亡蛋白的表达显着下降，MDA 和 Fe2+增加，促进骨肉瘤细胞产生过量ROS，诱导铁死亡发生。Liu 等[35]通过测定顺铂耐药的骨肉瘤细胞中铁死亡相关蛋白发现GPX4在耐药细胞中高表达，通过铁死亡诱导剂促进铁死亡的发生可增强骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性，进一步研究发现GPX4的减少和ROS的增多可以使耐药骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性得到相应的改善。β-异硫氰酸苯乙酯(β-phenylethyl isothiocyanate，PEITC)具有抗癌潜力，研究发现PEITC通过抑制K7M2骨髓骨肉瘤细胞，诱导氧化应激，GSH失活，MDA和ROS升高，GPX4减少，并且认为PEITC激活了MAPK信号通路，ROS生成是PEITC诱发细胞死亡的主要原因[36]。 姜黄素类似物联苯二氟酮(diphenyl difluoroketone，EF24)显著提高了MAD,ROS及细胞内铁的水平，上调血红素加氧酶1(Heine Oxygenase 1，HMOX1)抑制GPX4表达，诱导铁死亡，而Ferrostatin-1铁死亡抑制剂可抑制这一过程[38]。 Lei等[37]建立了基于铁死亡相关基因的骨肉瘤疾病预测模型，并取得了较好的预测效果。

3.3骨质疏松骨质疏松主要是各种原因导致骨密度和骨质量下降，影响骨的稳定性和功能。研究证实铁超载是骨质疏松发生的一个重要危险因素[39]，且与骨质疏松的发展呈正相关[40]，铁的异常积蓄会抑制成骨细胞的活性，并使破骨细胞的活性增加有关[41]。因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)具有诱导破骨细胞分化、发育、发挥功能的因子，Ni等[42]发现在有氧条件下RANKL可以影响铁的稳态，核受体辅激活因子 4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)介导铁蛋白在溶酶体中降解，发生铁自噬，引起游离铁的释放，继而脂质过氧化增加；在缺氧条件下，铁蛋白的降解被抑制，氧气可能对骨质疏松症的铁死亡过程产生影响。另有研究指出，ROS可影响破骨细胞的形成和分化，对骨的稳态产生不利影响[43-44]，RANKL 是骨吸收和骨形成耦联关键因子，肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)在RANKL通路介导ROS生产中起着关键的作用，其可通过激活Ras相关的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1) 使还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase ，NOX) 激活，导致 ROS 产生增加[45]。Liu等[46]证实,Loureirin B可以通过抑制活化T细胞核因子(nuclear factor-activated T cell 1,NFATc1)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)和ROS活性来改善RANKL诱导的破骨细胞生成和骨质疏松。

3.4脊髓损伤脊柱脊髓损伤是骨科常见疾病，由于各种因素导致脊柱稳定性受到破坏，脊髓压迫引起髓损伤可出现各种感觉及运动障碍。脊髓损伤后伴随损伤部位出血致使血红蛋白中的铁大量释放引起铁超载，产生过量的ROS引起铁死亡的发生[47]。在脊髓损伤的实验鼠脊髓组织内铁死亡标志物水平出现明显变化，且线粒体出现明显的铁死亡的特征性变化[48]。Zhang等[49]对实验性脊髓损伤鼠注射铁死亡抑制剂(SRS16-86)，发现可上调GPX4、SLC7A11和GSH表达，促进功能恢复。另有学者发现继发性脊髓损伤可导致少突胶质细胞大量减少[50]，GSH的减少与铁的大量增加引起少突胶质细胞的氧化损伤[51]，fan等[52]证实RSL3诱发少突胶质细胞铁死亡，并发现在抑制少突胶质细胞铁死亡方面Liproxstatin-1 比依达拉奉(edaravne, EDA) 或 去铁胺(deferoxamine，DFO)更有效，揭示了铁死亡在少突胶质细胞生存中的重要作用。脊髓损伤后，会诱发运动皮层铁超载，引起运动皮层中的神经元发生铁死亡，抑制铁死亡的进展可减轻神经元的死亡同时促进了脊髓损伤后的运动功能的恢复[54],锌可以通过核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1(nuclear factor erythroid 2-related factor 2/ heme oxygenase 1，NRF2/HO-1)和GPX4信号通路抑制神经元的铁中毒，一定程度上修复受损的线粒体并有效地减少了脊髓损伤和炎症因子的水平[53]。这些研究结果提示铁死亡在脊髓损伤中可能扮演着重要角色。

3.5椎间盘突出症腰椎间盘突出症(lumbar disc heniation，LDH)是引起慢性腰腿痛的常见原因之一，主要是腰椎间盘发生退行性变(iumbar intervertebral disc degeneration,IVDD)后，纤维环破裂，髓核组织突出到椎管内，相邻神经根受压，出现腰腿痛，下肢麻木等症状。Yang等[55]通过大鼠IVDD模型发现，退化椎间盘组织中GPX4，FTH的表达水平明显下降，而环氧合酶2(cyclooxygenase 2,PTGS2)、长链酯酰辅酶A合成酶4 (acyl-CoA synthetase long chain family member4，ACSL4)表达增加，将环状纤维细胞 (annular fibroblasts，AFC) 和髓核细胞 (nucleus pulposus cells，NPC)置于不同浓度的叔丁基过氧化氢 (tert-Butyl hydroperoxide， TBHP)中，随着TBHP浓度的增加，FTH和GPX4的表达降低，AFCs和NPC的脂质过氧化水平增加，并且AFC和NPC细胞中的线粒体出现了皱缩；使用铁死亡抑制剂DFO和Fer-1可逆转FTH和GPX4的下降趋势，而RSL3可以增加其下降趋势，证明了TBHP诱导的AFC和NPC中的细胞死亡与RSL3诱导的相似，并被DFO和Fer-1抑制；研究发现在突出的髓核中检测到血红色的分解增加，GPX4的减少，首次表明血红素诱导的HNPC与铁死亡诱导剂erastin和FAC相同的致死作用，并且HNPC诱导的铁死亡可被 DFO抑制，发现其其潜在机制可能与Notch途径有关[56]。Liu等[57]人的研究也证实，IVD中ROS的水平与IVDD进展呈正相关，且在TBHP诱导的人类NPC以及IVDD的人类髓核组织中，铁转运蛋白(ferroportin，FPN)表达下调。通过对照 NPC 和 TBHP 诱导的 NPC 中转染慢病毒质粒(Lenti-FPN)，结果显示 Lenti-FPN 感染上调了FPN 的表达，减轻了 TBHP 诱导的 NPC 细胞铁超载，也减轻了TBHP 诱导的 NPC 中的铁死亡，桧木醇(hinokitiol)可以通过恢复FPN的功能来减轻TBHP诱导的氧化应激和NPC铁凋死亡，证明了FPN在在人类NPC的铁死亡发生中发挥重要作用。

4 结 语

自 2012 年被发现铁死亡这一种新型细胞死亡形式以来，已成为目前研究热点。各种研究已证实，铁死亡在众多疾病的发生发展中可能扮演着关键作用，干预铁死亡的过程，不同程度上可改善相关疾病的发展。本文简要综述了铁死亡和骨骼、关节疾病之间存在的关系以及可能的机制，由于铁死亡的发生涉及多方面，机制复杂多样，许多关键问题尚待解决，但随着研究的深入、技术的完善，干预铁死亡有望成为骨骼、关节疾病非手术治疗，早期干预的切入点。