细胞衰老在肿瘤治疗应用中的研究进展

费彦亢，黄晨玮综述，于 兵审校

0 引 言

细胞衰老最初由Hayflick与Moorhead发现并描述：体外培养的人成纤维细胞在连续培养50～70代后即丧失增殖能力并进入生长停滞状态。在人体的其他增殖细胞中同样存在这种现象，这种细胞分裂至一定代数便陷入停滞的现象被称为复制性衰老[1]。实质上，细胞衰老是遗传、环境等共同作用的结果，多种刺激均能导致细胞衰老，这种与分裂代数无关的衰老称为细胞早熟衰老。细胞衰老在机体内广泛存在并贯穿于整个生命阶段，在肿瘤抑制、胚胎发育、机体衰老及组织修复等方面均发挥重要的生理作用。其中，肿瘤抑制是细胞衰老最广为人知的生理学作用，细胞衰老机制尤其是早衰的研究为癌症的发生、发展及治疗提供了新的方向与思路。传统的癌症治疗手段如放射疗法与化学疗法尽管能在短时间内迅速杀灭癌细胞，起到立竿见影的效果，但也会对机体造成较强的副作用，同时，转移与复发也是其治疗过程中不可回避的问题，从而使治疗效果难达预期。而被诱导衰老的肿瘤细胞在一定时间内仍能存活，但无法进行增殖与转移，从而可使肿瘤得到有效的控制[2]。本文就细胞衰老的标志、影响因素及其在肿瘤治疗中的作用作一综述。

1 细胞衰老的标志

与休眠细胞不同，衰老的细胞除生长停滞外，还具有一些共同的衰老表型与特征。包括扁平、扩大化的形态，内质网应激，线粒体数量增加，抗细胞凋亡等[3]。同时，在体外培养的衰老细胞中还可检测到衰老相关异染色质聚集(senescence-associated heterochromatin foci, SAHF)——一段被DAPI染色的与H3K9me3和HP-1定位相一致的DNA点状聚集分布区[4]。尽管衰老细胞处于生长停滞中，但仍具有相对活跃的代谢活性，合成大量蛋白质，如白细胞介素、生长因子、趋化因子和基质金属蛋白酶等，并以旁分泌的形式影响组织微环境，此标志性的特征被称为衰老相关分泌表型(senescent associated secretory phenotype, SASP)[5]。SASP在伤口愈合、组织微环境重塑及促进肿瘤增殖与转移等方面均具有重要的生物学功能[6]。细胞衰老的另一个特征还包括部分溶酶体蛋白的上调和溶酶体含量的增加[7]，其中，溶酶体衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence-associated beta-galactosidase, SA-β-gal)作为最常见的衰老标记物而被广泛应用于衰老细胞的检测[8]。但因其不能应用于石蜡包埋的组织切片和活细胞而存在一定的局限。近年来，脂褐素的积累亦被确立为细胞衰老的标记，其相关的苏丹黑B染色较SA-β-gal染色有着相对更广的应用面[9]。

2 诱导衰老的因素

除复制性衰老外，其他多种可能致癌的刺激均可导致细胞衰老，包括DNA损伤、癌基因激活、氧化应激、染色质改变等。

2.1 复制性衰老端粒磨损是最常见的导致细胞衰老的原因。端粒是位于线性染色体末端的DNA-蛋白质复合体，用以保护DNA免受降解或重组，维持其稳定。由于DNA末端复制时，每经历一个细胞周期，端粒将缩短约200bp直至临界长度而引发DNA损伤反应(DNA damage response, DDR)，并最终触发由p19ARF/p53途径介导的衰老反应[10]。

作为细胞分裂的计数器，复制性衰老在预防细胞癌变方面起到重要的作用。因此，肿瘤的发生与发展首先要实现端粒长度的维持。目前已知两种端粒维持机制(telomere maintenance mechanisms, TMM)：依赖端粒酶的端粒维持机制与端粒延长替代机制(alterative lengthening of telomere, ALT)。

人端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶，主要由端粒酶RNA(human telomerase RNA, hTR)、端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)及端粒酶相关蛋白组成[11]。正常人体内仅有极少数细胞表达端粒酶，而在大部分肿瘤细胞中皆可检测出其活性。以端粒酶为靶点的治疗手段已成为肿瘤治疗领域的重要研究方向，以端粒酶为指标判断肿瘤进展及预后在临床上也具有一定的应用[12]。

通常认为，TMM的类型在很大程度上取决于肿瘤细胞的组织来源。骨髓、肝脏、皮肤等组织干细胞表达有一定活性的端粒酶，起源于此的肿瘤细胞通常表现为依赖端粒酶的端粒维持机制。而来源于间充质组织(软组织、骨骼、中枢和周围神经系统及神经内分泌系统)的肿瘤则常表现为ALT的激活[13]。ALT的具体机制尚不明了，一般认为其主要依赖于同源重组延长端粒，并与端粒功能异常相关。目前发现主要存在三种主要类型的ALT，包括依赖重组酶RAD51的同源重组、依赖RAD52的断裂诱导复制和非依赖RAD52的断裂诱导复制[14]。

值得一提的是，尽管肿瘤必须依靠TMM才能实现细胞永生化，但有研究显示，部分肿瘤细胞中既无端粒酶活性，亦不存在ALT。通常而言，高表达的端粒酶存在于85%～90%的肿瘤细胞中，其余的10%～15%则利用ALT维持端粒，但一项针对31种癌症、18430个样本的研究显示，73%的样本表达端粒酶，5%表现为ALT阳性，而其余22%的样本则未表现TMM[15]。这提示部分肿瘤的形成可能并不一定要完全越过细胞衰老，在有限的分裂次数内，一些失去调控的细胞仍能形成具备一定规模的肿瘤包块。另一方面，端粒酶与ALT之间的分类也并不那么严格，两者可能同时存在于同一细胞中，甚至在一些情况下，依赖端粒酶的端粒维持机制与ALT可相互转换。

2.2 DNA损伤诱导的细胞衰老多种强烈的刺激如电离辐射、拓扑异构酶抑制剂等均能导致基因组的损伤甚至DNA双链的断裂，继而触发DDR。轻度的DNA损伤通常导致细胞周期停滞，进而对DNA进行修复，而严重的DNA损伤则会激活p53并引起细胞衰老或细胞凋亡，不同的结局可能取决于细胞的类型及其所处生理环境[16]。

2.3 癌基因诱导的细胞衰老癌基因诱导的衰老(oncogene-induced senescence, OIS)是最早被发现的非端粒相关的细胞衰老，Serrano最初于1997年发现RAS基因的表达并不导致恶性转化，而是引起细胞周期停滞。OIS的发生与DDR、肿瘤抑制因子p53的激活以及异染色质的形成所导致的细胞增殖相关基因的转录沉默密切相关[17]。多种基因的异常变化均可导致OIS并引起细胞衰老，包括BRAF、NRAS、HRAS和PIK3CA等[18]。OIS对癌基因的反应可以有效阻止异常细胞的癌变，对于维持机体的稳定具有重要意义。

2.4 氧化应激诱导的细胞衰老自由基造成的细胞损伤是导致衰老的主要原因之一。体内的自由基有多种来源，包括外源性的电离辐射(主要为紫外线)、某些药物和重金属离子，以及内源性的活性氧(reactive oxygen species, ROS)。正常情况下，体内的抗氧化物质与抗氧化酶能及时清除自由基而维持机体正常生理功能。当ROS与抗氧化系统失衡时，其可以造成生物膜、蛋白质及mtDNA的损伤[19]。高水平的ROS可直接作用于DNA，触发DDR及其他包括NF-κB、MAPK等多条通路造成细胞衰老[20]。

3 细胞衰老相关的肿瘤治疗策略

治疗诱导性衰老(therapy-induced senescence, TIS)可能代表了一种有效的癌症治疗手段。近年来随着衰老通路与机制的明确，相关药物的研究也取得了一定的进展。

3.1 常规肿瘤治疗中的细胞衰老常规的肿瘤治疗手段中，放疗与化疗仍起主导作用，主要对肿瘤细胞造成不可修复的DNA损伤或影响肿瘤细胞的核酸和蛋白质的结构与功能，从而杀伤、杀灭肿瘤细胞。而在治疗过程中常能检测到衰老细胞的存在，主要表现为SA-β-gal与SASP标记物的表达[21]。通常而言，细胞衰老对肿瘤起抑制作用，但在实际情况中则要复杂得多。在对Eμ-Myc淋巴瘤小鼠模型的研究中，化疗所引起的细胞衰老在肿瘤治疗中发挥积极的作用，其小鼠具有更好的预后[22]。而在实际的化疗中，肿瘤中衰老的细胞能够长时间存在，在治疗结束一年后仍能在血浆中检测到相关衰老标记物[23]。长期存在的衰老细胞因其促炎特性而影响局部组织的微环境平衡，尤其是SASP与肿瘤细胞的增殖与转移密切相关。

3.2 抑制TMM诱导肿瘤细胞衰老端粒酶及其在肿瘤中的重要作用的发现，为端粒酶抑制剂在抗肿瘤的应用提供了可能性。近年来有研究发现，基因疗法、免疫疗法等在抑制hTERT表达方面均能起到一定作用。将带有hTERT的慢病毒载体对树突状细胞进行转染，与对照组相比，其抗原呈递与抑癌作用有明显的提高[24]。此外，小分子端粒酶抑制剂、以端粒酶为靶点的溶瘤病毒及端粒酶肽疫苗在研究中亦表现出良好的应用前景。也有学者认为，以端粒酶为靶点与抗氧化途径的联合治疗是针对端粒酶重新激活的新型治疗策略[25]。

目前对ALT的具体分子机制尚不清晰，亦无特异性抗ALT的药物，但有研究发现当TSPYL5与USP7之间的联系被破坏后可导致ALT阳性的细胞死亡。ALT在肿瘤中所占比例较少，因此缺少相关方面的研究。然而，由于小儿肿瘤起源于间充质细胞的较多，因此，有学者认为有相当一部分的小儿肿瘤会激活ALT[26]。与此同时，有研究表明，端粒酶在一定情况下可以转化为ALT。如膀胱癌T24细胞可通过促进上皮细胞-间充质转化而由端粒酶向ALT转化[27]。提示可能与端粒酶抑制剂的耐药性相关。

与端粒酶相关的肿瘤治疗策略在实际应用中仍存在许多问题，包括端粒酶被抑制后肿瘤在一定时期内依然能够增殖、耐药性的产生以及相关药物对造血系统及其他组织产生不良反应等。端粒酶抑制剂与其他抗肿瘤药物联合用药或作为肿瘤治疗的辅助药物是可考虑的治疗策略。

3.3 以p53为靶点诱导肿瘤细胞衰老p53是重要的抑癌基因之一，通常被DNA损伤、缺氧、癌基因过表达等应激状态所激活，从而在细胞衰老的信号传导途径中发挥着重要的作用。众多研究表明以p53为靶点可诱导肿瘤细胞进入衰老状态。由于p53基因的突变或受p53负调节因子的抑制，p53在相当一部分数肿瘤中均表现为失活状态[28]。针对这两种机制，近年来有关突变型p53重激活与p53负调节剂抑制剂都取得了令人欣喜的进展。

P53突变通常是错义突变，p53突变基因仍能进行转录和翻译，同时，正常细胞中p53蛋白的半衰期较短，但在肿瘤中p53突变体蛋白不易降解而会积累。因此，就肿瘤治疗而言，重新激活p53突变体可能是一种潜在的治疗策略。动物实验表明，引入野生型p53后，能够促进不同肿瘤细胞发生细胞凋亡或衰老[29]。尽管有人认为p53突变体无法被利用，但近年来研究发现，一些药物对于p53突变体蛋白确实具有一定的激活作用，如PRIMA-1、APR-246、PK7088、PK11000、COTI-2以及一些小分子肽[30-31]。

而在另一些未发生p53基因突变的肿瘤中，其表达水平处于较低的状态，主要是受到p53负调节剂的调控，其中，MDM2是研究最广泛的负调节因子。MDM2可与p53 DNA的N端及其他区域结合以抑制p53的转录并促进p53蛋白的降解[32]。Nutlin-3最初被发现可与MDM2结合，阻断MDM2与p53的相互作用，但其作用效果有限且副作用大，而较少用于临床[33]。近年来一些新型的效果更好的MDM2靶向药物被发现并用于临床测试，如MI-219、RG7388、HDM201等[34]。

3.4 抑制CDK诱导肿瘤细胞衰老另一种可能的治疗方法是通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)以诱导细胞周期阻滞，从而促进肿瘤细胞的衰老。目前发现多种药物能抑制CDK的活性，包括TG-02、LEE011、LY2835219、dinaciclib[35]以及已上市的palbociclib[36]。然而，尽管许多药物能对CDK产生作用，但在实际临床试验时却发现并没有达到理想的效果。在随后的研究中发现，CDK抑制剂联合应用其他抗肿瘤药物时，则能产生较好的效应。因此，目前更倾向于CDK抑制剂的协同用药。

3.5 抑制c-Myc诱导肿瘤细胞衰老c-Myc基因激活是导致肿瘤发生的主要原因之一。c-Myc突变可导致肿瘤细胞不依赖于生长因子的增殖，这种现象在大多数肿瘤中均有所表现，通过抑制c-Myc，可能会阻止肿瘤的进一步发展，以达到控制癌症的目的[37]。有研究显示，通过抑制肿瘤细胞中c-Myc的表达，可使骨肉瘤、淋巴癌及肝细胞癌发生细胞衰老，并且在一些肿瘤中，还伴随着免疫系统的介入，导致肿瘤的缩小[38]。在对急性髓性白血病的研究中发现，Myc的高表达水平与患者不良预后相关，因此，通过检测Myc的活性水平，可能可用于肿瘤患者的预后评价。目前主要存在直接抑制与间接抑制c-Myc的两种方式，前者作用于c-Myc与MAX的相互作用，主要药物有10058-F4与KJ-Pyr-9[39]。后者则在转录与翻译水平抑制c-Myc的表达，包括BET抑制剂及CDK7抑制剂、THZ1等[40]。

4 细胞衰老对肿瘤的双重作用

尽管细胞衰老在防止正常细胞的癌变方面发挥重要的作用，然而应该指出的是，肿瘤中持续存在的衰老细胞却会对肿瘤发展起到不可忽视的促进作用。在此过程中，SASP起到了主要作用。

SASP包括多种炎症介质、生长因子、细胞因子及基质金属蛋白酶。SASP如同一把双刃剑，一方面，早期阶段的SASP可以促进组织修复、激活免疫系统以及引发衰老细胞的免疫监视[41]，另一方面，长时间的SASP能够重塑微环境，导致慢性炎症而促进肿瘤的发展。在对乳腺癌的研究中发现，衰老的间充质干细胞能分泌IL-6而促进肿瘤的增殖与转移[42]，而在另一项研究中，衰老的成纤维细胞促进了永生化的非瘤性乳腺上皮细胞的恶性转化[43]。SASP受p53的负调控，在p53突变失活的肿瘤中，SASP表现出更强的促肿瘤作用。

值得一提的是，尽管普遍认为细胞衰老是不可逆的，但有证据显示，衰老的肿瘤细胞可以逃离细胞周期停滞并回复增殖能力[44]。在使用依托泊苷与阿霉素等拓扑异构酶II抑制剂诱导H460细胞衰老的实验中，部分SA-β-gal阳性的细胞最终能够恢复增殖并表现出形成肿瘤的潜能[45]。提示化疗与放疗等肿瘤治疗中肿瘤的复发可能与此有关，另一方面，细胞衰老在某种程度上甚至可能成为逃避治疗的一种休眠手段，而与其对TIS的耐药性相关。

5 衰老细胞的清除

由于衰老细胞的旁分泌在肿瘤发展中的促进作用，以单纯的诱导肿瘤衰老的治疗手段可能并不能达到理想的治疗预期与效果。因此，选择性清除肿瘤周围组织中的衰老细胞可能成为一种新的辅助治疗手段，而被称为衰老细胞清除治疗(senotherapy)。

最初的衰老细胞清除治疗药物是达沙替尼和槲皮素的组合，在实验中，联合用药增强了年老小鼠的心血管功能，减轻了单腿受辐射的功能障碍，使其运动能力得到改善，对早衰小鼠使用后，小鼠肌张力障碍减轻，共济失调和步态障碍的发作被延迟，改善了其健康状况[46]。另外，Bcl-2抑制剂在研究中亦表现出良好的作用，能有效抑制衰老细胞的抗凋亡作用并促使细胞凋亡。相关药物ABT-263对于衰老的卵巢癌细胞与乳腺癌细胞均有较好的杀伤作用[47]。事实上，衰老细胞不仅能增强肿瘤的侵染性，正常组织中衰老细胞的积累也会造成极大的损害，通过清除衰老细胞，许多慢性病如骨质疏松、动脉粥样硬化、心功能障碍亦能有所改善[48]。

6 结语与展望

综上，细胞衰老在肿瘤的发生、发展以及治疗过程中均发挥着重要的作用。细胞衰老是防止正常细胞癌变的天然屏障，多种能促进细胞癌变的刺激均能触发细胞周期停滞，导致细胞衰老，从而维持组织的平衡，这在人体中具有极其重要的生理学意义。而多数肿瘤细胞都能逃离细胞衰老，从而实现细胞的无限增殖。随着细胞衰老途径的发现与明确，重新诱导肿瘤细胞衰老成为肿瘤治疗的新兴策略。近年来也开发了多种作用于不同靶点的药物，从多方面诱导肿瘤细胞陷入生长停滞。但另一方面，衰老细胞持续存在，其相关的SASP能重塑组织微环境，促进慢性炎症，破坏微环境的平衡，从而促进肿瘤细胞的增殖与转移。同时，有证据还显示诱导衰老的肿瘤细胞还可能再次逃脱衰老而恢复增殖能力，这可能与肿瘤在放疗和化疗过程中耐药性的产生和复发密切相关。因此，对于肿瘤中衰老细胞的清除也应是肿瘤治疗的一部分，这不仅能增强肿瘤的治疗效果，对于治疗的预后也有积极的意义。