内质网应激因子PERK在抑郁模型大鼠海马组织中的表达及β—细辛醚的干预作用

耿道明　金铭　杨盼盼　李成冲　董海影　赵阿勐　张晓杰　蔡珍珍

【摘要】 目的：探討内质网应激因子PERK在抑郁模型大鼠海马组织中的表达及β-细辛醚的干预作用。方法：将100只SD大鼠随机分为5组（正常对照组、模型组、氟西汀组、β-细辛醚低剂量组和高剂量组），每组20只。孤养结合慢性不可预见性刺激，模型复制成功后第2天给予氟西汀组和β-细辛醚组1次/d灌胃，给药剂量分别为氟西汀10 mg/（kg·d）、β-细辛醚25 mg/（kg·d）、β-细辛醚50 mg/（kg·d）。于实验前和实验第29天，对大鼠进行行为学测量，采用免疫组织化学检测法检测PERK蛋白水平。结果：经28 d慢性不可预见性温和刺激（CUMS）后，模型组大鼠水平运动和垂直运动得分均明显低于正常对照组（P<0.05）；β-细辛醚低剂量和高剂量组与氟西汀组大鼠水平和垂直运动得分均明显高于模型组（P<0.05）。模型组大鼠海马区PERK蛋白表达明显高于正常对照组（P<0.05），β-细辛醚低、高剂量组与氟西汀组大鼠海马区PERK蛋白表达均明显低于模型组（P<0.05）。结论：β-细辛醚可以改善大鼠抑郁行为，其机制可能与降低大鼠海马组织中PERK蛋白表达有一定关联。

【关键词】 内质网； 应激； 抑郁； 大鼠

Expression of Endoplasmic Reticulum Stress-regulating Factor PERK in Hippocampus of Depressive Rats and Intervention of β-asarone/GENG Dao-ming，JIN Ming，YANG Pan-pan，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（15）：004-007

【Abstract】 Objective：To study the expression of endoplasmic reticulum stress regulators PERK in hippocampus of depressive rats and the intervention effect of β-asarone.Method：120 SD rats were randomly divided into 5 group（normal control group，model group，Fluoxetine group，β-asarone low dose group，β-asarone high dose group，20 rats in each group.Solitary feeding combined with chronic unforeseen mild stimuli（CUMS），and then on the 2nd day after the model establishment，rats in Fluoxetine group and β-asarone group were treated with Fluoxetine[10 mg/（kg·d）]，β-asarone [25 mg/（kg·d），50 mg/（kg·d）] once daily by intragastric administration.Behavioral measurements were made before and the twenty-ninth days after the experiment and the level of PERK protein was detected by immunohistochemistry.Result：After CUMS for 28 days，the scores of horizontal motion and vertical motion in model group were lower than those in normal control group （P<0.05），the levels of vertical and horizontal movements in the β-asarone low dose and high dose group and Fluoxetine group were significantly higher than that in the model group （P<0.05）.The expression of PERK protein in hippocampus of model group was significantly higher than that in normal control group （P<0.05），the expression of PERK protein in the hippocampus of rats in the β-asarone low， high dose group and Fluoxetine group were significantly lower than that in the model group （P<0.05）.Conclusion：β-asarone could alleviate the symptoms of depression in rats effectively，its mechanism might be related to decreasing the protein expression of PERK in the rat hippocampus.

【Key words】 Endoplasmic reticulum； Stress； Depression； Rat

First-authors address：Qiqihaer Medical College，Qiqihaer 161006，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.15.002

抑郁症的发病率呈现逐年增加的趋势，其病因较为复杂，病程较长，严重影响个人及家庭的生活质量[1]。近年来研究发现，内质网应激在神经系统疾病发生、发展中的作用也开始逐渐被关注，关于内质网应激可以引起神经元的凋亡已经在许多神经退行性疾病的发病机制研究中得到证实[2]，另有数据证实内质网应激亦是自噬的诱导因素[3-4]，自噬平衡内质网应激诱导的内质网膨胀，维持细胞存活，也可以调节大鼠抑郁症状。本实验主要从内质网应激角度，探讨内质网应激因子PERK在抑郁模型大鼠海馬组织中的表达。

1 材料与方法

1.1 动物及药品 （1）动物：清洁级SD大鼠，2～3月龄，体重180～200 g，哈尔滨医科大学实验动物医学部，许可证号SCXK（黑）2013-0001。（2）药品及试剂：β-细辛醚标准品（天津一方科技有限公司，批号00011017-T9K），盐酸氟西汀胶囊（苏州俞氏药业有限公司，批号100201），蛋白激酶R样内质网激酶PERK抗体（美国Cell Signaling公司，批号为#9451），山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG（北京康为世纪生物科技有限公司，批号分别为CW0103、CW0105）。

1.2 仪器 CX31R BSF型光学显微镜（Olympus），DP801型图像分析系统（Alphamiager公司），DK-8D型电热恒温水浴箱（上海合恒仪器设备有限公司），THZ-82型恒温振荡器（江苏太仓医疗器械厂），AL204型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），METTLER TOLEDO 型PH测试仪（上海秋腾贸易有限公司），79-1型磁力加热搅拌器（上海雷磁新泾仪器有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 造模及给药 大鼠适应性喂养1周后，随机分为5组，每组20只大鼠。正常对照组不给予任何刺激和药物；模型组给予生理盐水灌胃；氟西汀组给予盐酸氟西汀10 mg/（kg·d）；β-细辛醚低剂量组给予β-细辛醚25 mg/（kg·d）灌胃；β-细辛醚高剂量组给予β-细辛醚50 mg/（kg·d）灌胃。对照组大鼠每5只一笼饲养，自由饮食饮水。其他各组大鼠单笼孤养，采用慢性不可预见性刺激处理[5]，持续28 d，每种应激方式使用不超过3次，避免大鼠耐受。具体应急方式为：禁食水24 h、热刺激5 min（45 ℃）、夹尾3 min、强迫冰水游泳10 min（4 ℃）、鼠笼倾斜24 h（45°）、束缚24 h、潮湿环境24 h、声音刺激12 h（120 dB）、昼夜颠倒、摇晃1 h、闪光灯照射12 h、通宵拥挤。除对照组外其余各组大鼠从造模开始后第8天开始给予生理盐水或相应药物，1次/d，共28 d。

1.3.2 行为学评价 在实验前和实验第29天进行旷场实验（Open-field-test）观察各组大鼠行为学变化。实验用敞箱为无盖方箱，高40 cm，长宽均为125 cm，箱内四壁涂成黑色，底板白色，底板用黑线划成25个25 cm×25 cm的等边方格。实验进行时环境安静，敞箱周围参照物不变。将单只大鼠轻放于敞箱底板正中心的方格内，记录大鼠3 min内动作行为表现包括水平穿越格数、直立次数。以大鼠的四肢完全进入一个方格区域作为水平运动的1分，以双前肢完全抬离地面作为直立次数的1分。每只大鼠单独测试，每检测完一只大鼠后用75%乙醇彻底清洁敞箱并干燥后再进行下一只大鼠的检测。

1.3.3 免疫组织化学法检测大鼠海马组织PERK蛋白表达 取石蜡包埋的大鼠海马组织，于相应部位进行连续切片各5张，脱蜡和水化后进行抗原修复。采用过氧化物酶标记的链霉卵白素（SP）法进行免疫组织化学染色，并DAB显色，经过苏木素复染、PBS洗涤、盐酸乙醇分化后返蓝，常规脱水、透明、中性树胶封片。每一张切片在阳性表达区域挑选10个无重叠视野，使用Olympus显微镜、DP801形态分析软件进行图像采集处理，测出PERK蛋白抗原表达总面积、阳性细胞数和平均吸光度A，计算积分吸光度（IA）。

1.4 统计学处理 运用SPSS 22.0软件包，计量资料用（x±s）表示，比较采用One-way ANOVA单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学评价结果比较 实验开始前1 d进行旷场实验，各组大鼠水平运动和垂直运动得分比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。经28 d慢性不可预见性温和刺激后，与正常对照组比较，模型组大鼠水平运动和垂直运动得分均明显减少（P<0.05）；与模型组比较，氟西汀组、β-细辛醚低剂量和高剂量组大鼠水平和垂直运动得分均明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 大鼠海马组织PERK蛋白表达 模型组大鼠海马区PERK蛋白表达明显高于正常对照组，通过图像分析成像系统分析测得PERK积分光密度值为（24.56±1.25），较正常对照组的（8.33±1.01）高，差异有统计学意义（P<0.05）。氟西汀组与β-细辛醚低、高剂量组大鼠海马区PERK蛋白表达分别为（10.30±1.75）、（18.72±2.01）、（16.33±1.84），均明显低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。各组蛋白表达见图1。

3 讨论

实验通过孤养结合CUMS制造大鼠抑郁模型，通过旷场实验评价实验受体在新环境中的自主行为、紧张程度，有效评价大鼠抑郁模型复制结果[6-8]。该实验中模型组大鼠28 d后测得水平运动与垂直运动得分均较正常组降低，大鼠出现明显的抑郁症状，达到预期造模水平。β-细辛醚低、高剂量组与氟西汀组大鼠旷场实验分数较模型组增加，提示β-细辛醚可以改善大鼠抑郁样行，这与笔者前期的实验相吻合[9-11]。

PERK属于ERS感受器中的一种，内质网应激早期，PERK通过自身磷酸化和二聚化使真核细胞蛋白翻译起始复合体（eukaryotic translation initiation factor 2，eIF2）的α亚基第51位的丝氨酸Ser发生磷酸化，阻止与葡萄糖羟基转移酶结合，抑制目标蛋白质的起始翻译，阻碍蛋白质的合成，降低细胞内的蛋白负荷，减轻ER的负担[12-14]。细胞激活PERK基因的表达后，胞内的蛋白翻译作用迅速减少，细胞周期蛋白D1（cyclin D1）急剧减少，使停滞在G1期的细胞大量增加[15]。PERK、ATF6、IRE-1增加的Ca2+也已被证实是ERS诱导自噬的调节者。该实验中，抑郁模型组大鼠海马组织中的PERK蛋白高表达，给予β-细辛醚或阳性药物的动物组，PERK表达降低，提示PERK可以预测大鼠海马神经元受损程度。石菖蒲作为中医治疗脑病的常用药物，以其醒神益智、健脑开窍为主要作用。根茎中主要成分是挥发油，包含α-细辛醚和β-细辛醚[16]。

近10年研究发现，内质网应激是区别于线粒体途径且能导致细胞凋亡的一条新的通路，内质网应激目前在胰腺、神经元、肝脏等细胞发病机制中研究热门[17]，在抑郁发生、进展过程中的作用尚未明确，笔者前期对抑郁模型大鼠行为及其海马神经元转归做了大量实验研究[18-20]，已证实β-细辛醚对抑郁大鼠模型有较明确的治疗作用，目前主要针对内质网应激调节抑郁模型大鼠相关因子的研究，此方面还需要进一步探讨及大数据的支持，笔者下一步将对内质网应激调节通路进一步探索。

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（收稿日期：2017-04-05） （本文编辑：张爽）