富含脯氨酸蛋白11在鼻咽癌组织中的表达及其对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响

李 特 ，刘蓉蓉，肖 雅，吴晓平

0 引 言

鼻咽癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一，患者的预后情况十分不乐观，主要原因是因为干预治疗后的鼻咽癌容易再次复发、远端转移和耐药，因此寻找鼻咽癌发展过程中的关键靶点，开发新的诊断生物标志物对防治鼻咽癌有重要意义[1-2]。富含脯氨酸蛋白11(proline-rich protein 11，PRR11)是最近发现肿瘤相关基因[3]。有研究发现[4]，与癌旁组织相比，胃癌组织中的PRR11蛋白呈高表达状态，且尤其高表达于恶性胃癌患者的组织中；也有研究发现[5]，PRR11能调控肺癌细胞周期形成参与肺癌的发生发展过程，提示其可能成为肺癌诊断或治疗的潜在靶点。还有更多研究发现，PRR11在食管癌[6]、胰腺癌[7]、舌鳞癌[8]等多种肿瘤组织及肿瘤细胞中高表达的现象，但目前尚未见有关PRR11在鼻咽癌组织及肿瘤细胞中的研究报道。本研究拟通过检测PRR11在鼻咽癌组织和细胞中的表达水平，分析PRR11的表达与鼻咽癌临床病理特征之间的相关性，进一步观察沉默PRR11对鼻咽癌细胞株体外侵袭、迁移能力的影响，探讨PRR11与鼻咽癌发生发展的关系，为临床上鼻咽癌的治疗提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 组织来源收集于2017年1月至2018年12月期间在陆军军医大学大坪医院经病理学确诊为鼻咽癌的癌组织及其相应癌旁组织标本54份，其中临床分期Ⅰ期～Ⅳ期分别有8份、14份、19份和13份。

1.2细胞及主要试剂正常鼻咽上皮细胞NP69及鼻咽癌细胞系CNE-1、CNE-2、6-10B、HONE-1、SUNE-1购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。PRR11 siRNA序列设计及合成由上海吉玛公司完成；胎牛血清和RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；MTT检测试剂盒和免疫组化染色试剂盒购自上海碧云天生物研究所；逆转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；LipofectamineTM 2000和RNA抽提试剂盒购自美国Invitrogen公司；Transwell小室购自美国Corning公司；PRR11、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH抗体购自美国Abcam公司。

1.3免疫组化法检测癌组织及癌旁组织中PRR11蛋白的表达将癌组织和癌旁组织蜡块切成约2 μm的薄片，行常规脱蜡、梯度乙醇逐级水化，采用柠檬酸钠缓冲溶液进行抗原修复，滴加稀释后(1∶100)的PRR11一抗于切片上，置于4 ℃孵育过夜，次日以PBS洗涤3次，每次6 min，再加入二抗37℃孵育60 min，PBS洗涤3次，每次6 min。取DAB显色液I和II加至适量的水中，配成DAB工作液滴加到切片上，室温显色，苏木精复染、自来水冲洗、梯度乙醇脱水、二甲本苯透明、中性树胶封固、干燥，最后于显微镜下分析拍照，每张切片随机取3个视野进行观察。PRR11阳性染色主要定位于细胞质中，呈棕黄色颗粒，具体评分标准如下表，两项乘积≤4分为低表达，>4分为高表达[9]。

1.4细胞培养配置含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI1640培养基，所有细胞复苏后均用该培养基培养，细胞培养箱条件设置为37 ℃、5% CO2，根据细胞生长情况每2～3天传代1次。

1.5细胞感染及分组处理取对数生长期的CNE-1细胞进行转染，将细胞分为空白对照组、siRNA对照组)和PRR11干扰组。参照LipofectamineTM 2000说明书进行操作，混合LipofectamineTM2000和siRNA的稀释液，摇匀后室温下静置30 min，待细胞贴壁且生长密度达到70%后将混合液加入到细胞板中，轻摇细胞板使混合液与细胞培养液混合均匀，孵育6 h后换为含血清的培养基继续培养，收集转染48 h的细胞采用qRT-PCR和Western blot法检测转染效率。

1.6qRT-PCR检测收集各细胞样本，采用Trizol法提取各样本的总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度。取2 μg总RNA采用逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。引物序列，PRR11正向引物：5′-GACTTCCAAAGCTGTGCTTCC-3′，反向引物：5′-CTGCATGGGTCCATCCT TTTT-3′；GAPDH正向引物：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，反向引物：5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。反应条件为95℃预变性60 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算PRR11 mRNA相对表达量。

1.7Western blot检测收集各细胞样本加入RIPA裂解液提取总蛋白，4 ℃条件下12000 r/min离心20 min，收集沉淀用BCA法定量后于100 ℃下使蛋白变性，向电泳槽中加入电泳缓冲液并保持玻璃板内侧液面高于外侧，取15 μg蛋白上样进行凝胶电泳(浓缩胶恒压90 V，溴酚蓝进行分离胶界面；分离胶恒压160 V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部)，电泳结束后取出凝胶转移至PVDF膜上。将膜完全浸没封闭液，用TBST稀释一抗(PRR11、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH抗体，1:1000)，室温孵育10 min，放4 ℃过夜，次日取出膜，在室温孵育30 min，TBST洗膜5次，每次10 min。用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，室温轻摇 30 min，TBST洗膜5次，每次5 min。加入ECL于膜上反应5 min，曝光、显影、定影、凉片，采用Image J软件进行灰度分析，以GAPDH为内参计算各蛋白相对表达量。

1.8CCK8法检测细胞增殖活性收集转染后的CNE-1细胞接种于96孔板，使细胞密度为2×103个/孔，在培养箱中培养24、48和72 h后每孔加10 μL CCK8溶液孵育2 h，使用酶标仪测定结果，在450 nm波长处测定各孔的A值，以A450值表示细胞增殖活性。

1.9Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力收集转染后的CNE-1细胞，用无血清培养基悬浮细胞，在Transwell上层小室加入细胞悬液并调整细胞密度为4×104个/孔，下层小室则加入含10%胎牛血清的RPMI 1640全培养基，37 ℃培养箱继续培养24 h后，用棉签擦拭掉上室中未穿过膜的细胞，PBS冲洗小室3次，甲醇固定，0.1%结晶紫溶液对转移细胞进行染色，中性树胶封固，于显微镜下观察，随机选取5个视野，200倍光学显微镜下拍照计数每个视野内穿透小室微孔膜的细胞数，计算平均数。细胞侵袭实验的Transwell小室上室提前加入稀释后的基质胶，其余操作同迁移实验。

2 结 果

2.1 PRR11在鼻咽癌组织中的表达PRR11主要表达在细胞质中，在鼻咽癌组织中高表达，在鼻咽癌癌旁组织中低表达。PRR11在鼻咽癌组织中高表达率为68.52%(37/54)，低表达率为31.48%(17/54)，而癌旁组织中PRR11高表达率为16.67%(9/54)，低表达率为83.33%(45/54)，鼻咽癌癌旁组织及癌旁组织中PRR11表达差异有统计学意义(χ2=29.689，P=0.000)。见图1。

a:PRR11在鼻咽癌组织中高表达；b: PRR11在鼻咽癌癌旁组织中低表达

2.2PRR11在鼻咽癌细胞株中的表达与正常鼻咽上皮细胞NP69相比，鼻咽癌细胞系CNE-2、6-10B、CNE-1、HONE-1、SUNE-1中PRR11的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，在CNE-1细胞中表达最高。见图2。

1：NP69； 2：HONE-1； 3：SUNE-1； 4：6-10B； 5：CNE-2； 6：CNE-1

2.3沉默PRR11对CNE-1细胞中PRR11表达的影响空白对照组或siRNA对照组比较，si-PRR11干扰组细胞中PRR11 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。见图3。

1：空白对照组； 2：siRNA对照组；:3：si-PRR11干扰组

2.4沉默PRR11对CNE-1细胞增殖活性的影响细胞培养24、48和72 h时，与空白对照组或siRNA对照组比较，si-PRR11干扰组细胞增殖活性显著降低(P<0.05)。见图4。

与空白对照组或siRNA对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.5沉默PRR11对CNE-1细胞侵袭和迁移的影响与空白对照组或siRNA对照组比较，si-PRR11干扰组细胞迁移和侵袭数目显著减少(P<0.05)。见图5，表1。

图 5 各组细胞迁移和侵袭能力比较(结晶紫染色 ×200)

表 1 各组细胞迁移和侵袭数目比较个/视野)

2.6沉默PRR11对CNE-1细胞EMT相关蛋白表达的影响与空白对照组或siRNA对照组比较，si-PRR11组细胞中Vimentin和N-cadherin蛋白水平显著下调，E-cadherin蛋白水平均显著上调(P<0.05)。见图6。

1：空白对照组； 2：siRNA对照组；3：si-PRR11干扰组

3 讨 论

PRR11是最近发现的一个位于染色体17q23的新基因，参与细胞周期的调控，在多种肿瘤组织中高表达。有研究指出PRR11可能作为促癌基因在肿瘤的预后及靶向治疗方面发挥作用[10]。本研究通过免疫组化的方法检测了PRR11蛋白在鼻咽癌组织和癌旁组织中的表达情况，同时采用qRT-PCR和Western blot法检测了PRR11在5种鼻咽癌细胞系和正常鼻咽上皮细胞中的表达，研究结果显示，PRR11蛋白在鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞系中的表达显著高于其在对应的癌旁组织及正常鼻咽上皮细胞中的表达，初步提示PRR11可能为鼻咽癌的差异蛋白。进一步结合临床病理特征发现，鼻咽癌组织中PRR11蛋白的表达与淋巴结转移相关，提示PRR11蛋白在淋巴结转移方面可能具有靶向治疗的作用。

肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力增强与肿瘤浸润、转移和复发有着密不可分的关系[11]，Zhang等[12]研究结果显示，沉默PRR11能使肺癌细胞的增殖、转移和侵袭能力得到明显抑制；另有研究证实[13]，shRNA干扰PRR11表达能抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，同时降低其体内成瘤能力。为明确PRR11在鼻咽癌中的具体作用，本研究选择PRR11表达较高的鼻咽癌CNE-1细胞，应用siRNA技术沉默CNE-1细胞中PRR11基因表达，观察其对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，研究结果显示，PRR11表达下调的CNE-1细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显下调，说明PRR11基因在鼻咽癌的浸润转移中发挥正向调控作用。

肿瘤的转移方式与上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)密切相关[14]。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin是EMT进程中的标志性蛋白，在肿瘤侵袭、转移和细胞黏附过程中起到至关重要的作用[15]。鼻咽癌的发生发展与多种促癌或抑癌基因的EMT过程有关[16-17]，但PRR11在鼻咽癌中的作用是否与EMT相关尚未有文献报道。为进一步明确PRR11与EMT在鼻咽癌的浸润转移中存在的关系，本研究检测了转染si-PRR11前后CNE-1细胞中EMT相关蛋白的表达水平，研究结果显示，si-PRR11组细胞中Vimentin和N-cadherin蛋白水平显著下调，而E-cadherin蛋白水平均显著上调，说明沉默PRR11基因表达能引起EMT相关蛋白表达变化进而抑制鼻咽癌细胞的运动能力。

综上所述，PRR11在鼻咽癌组织和细胞中高表达，通过siRNA技术干扰PRR11的表达能显著抑制鼻咽癌细胞EMT过程，从而抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示PRR11作为肿瘤促进因子参与鼻咽癌进展过程，可能为其应用于临床指导鼻咽癌治疗提供理论依据。