微卫星不稳定型胃癌的研究进展

李立立，王艳军，安有志

聊城市第二人民医院肿瘤内科，山东 临清 252600

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其预后不仅取决于分期，还取决于特定的分子分型和组织病理学特征。胃癌是一种复杂的异质性疾病，根据癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA），胃癌可分为4种亚型：①EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）阳性型；②高度微卫星不稳定（microsatellite instability-high，MSI-H）型；③基因组稳定（genomically stable，GS）型；④染色体不稳定（chromosomal instability，CIN）型[1]。MSI-H是其中独立的亚型，尽管MSI-H在结直肠癌中作为预后的预测因素已得到充分证实，但微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）与胃癌临床病理特征之间的关系仍然不明确。本文主要对MSI型胃癌的研究进展进行综述并重点关注MSI-H型胃癌。

1 MSI的定义

错配修复系统与肿瘤的发生密切相关。微卫星又称短串联重复序列，是DNA基因组中小于10个核苷酸的简单重复序列，约占人类基因的10%，核心序列为16 bp[2]。MSI是指重复序列的插入和缺失导致微卫星长度发生改变，出现新的等位基因，其首次于1993年由Altonen等在遗传性非息肉性直肠癌中发现，然后在多种恶性肿瘤如胃癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌中均发现MSI。Bethesda标准通过对常用的5个微卫星位点（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250）进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测，2个或2个以上位点不稳定判定为MSI-H，1个位点不稳定判定为低度微卫星不稳定（microsatellite instability-low，MSI-L），无位点不稳定判定为微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）。当错配修复基因缺陷时，碱基错配不能被修复进而产生突变，尤其是在微卫星这种具有重复序列的区域，从而产生MSI表型，错配修复基因产物主要包括mutL同源物1（mutL homolog 1，MLH1）、PMS1同源物2（PMS1 homolog 2，PMS2）、mutS同源物2（mutS homolog 2，MSH2）、mutS同源物 6（mutS homolog 6，MSH6）4种错配修复蛋白（mismatch repair protein，MMRP）。其中MLH1和MSH2最为重要，其主要功能是负责对错配位点进行识别和切除。目前认为MSI的发生机制主要是DNA多聚酶滑动从而导致重复序列中的1个或多个碱基发生错配，或微卫星同源重组时导致不对等性碱基插入或丢失。

2 MSI在胃癌中的发生率

关于MSI在胃癌中的发生率，各文献报道并不一致（2.7%～45.0%）[3-4]。MSI-H型胃癌的发病率因地区、国家和种族而异，在西方国家中，MSI型胃癌的发病率为22.0%[5]，亚洲为11.7%～33.8%[6]，欧洲为16.3%～25.2%[6]。日本报告的胃癌患者中，MSI-H型胃癌占10.0%；世界卫生组织报告的胃癌患者中，MSI-H型胃癌占13.0%；TCGA报告的胃癌患者中，MSI-H型胃癌占21.6%[7]。韩国一个研究小组报告了胃癌中MSI-H的发生率，在所有胃癌患者中，MSI-H的发生率为3.2%；在早期胃癌患者中，MSI-H的发生率为10.3%；在晚期胃癌患者中，MSI-H的发生率为19.7%[8]。胃腺瘤逐渐发展至胃癌的过程中，MSI-H的发生率逐渐升高，这可能提示MSI-H型胃癌是通过胃腺瘤逐渐发展而来的[7]。有研究纳入120例胃腺癌患者，其中MSI/错配修复缺陷（mismatch repair deficiency，dMMR）型胃腺癌占11.7%[9]。

MSI-H型胃癌中hMLH1和hMSH2突变率较低，分别为15%和12%，因hMLH1启动子甲基化所致的MSI-H占比超过50%[10]。有研究者对60例胃癌患者进行微卫星分析，结果发现10例（16.7%）MSI阳性患者免疫组织化学染色（immunohistochemistry staining，IHC）显示，仅6例（10%）患者缺乏 MLH1（n=3）或 MSH2（n=3）蛋白表达，MSI阳性患者中最常见的微卫星标记是BAT26（90%）[11]。

综合国内外相关文献，MSI-H型胃癌的发病率并不一致，但整体而言，MSI-H型胃癌在临床不常见，其发病率并不高[3-4,12]。MSI-H型胃癌的发病率因国家和种族的不同而不同，除此之外，MSI-H的诊断缺乏统一的标准也是导致发病率不同的原因[5-7,12-13]。

3 MSI的检测方法

MSI的检测方法主要包括PCR和IHC。PCR被认为是检测MSI的金标准，其主要是从肿瘤组织中提取DNA，对其常用的5个微卫星位点（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250）进行扩增，将扩增的片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以检测微卫星位点的不稳定性[2]。其缺点是无法显示4种修复蛋白中哪种蛋白功能缺陷，且实验时间较长，大约需2周，而且对实验室的条件要求高，价格昂贵。IHC通过检查肿瘤组织中错配修复蛋白的缺失情况以确定微卫星状态，具有费用低廉、耗时短、操作简便、对实验仪器要求不高以及便于临床推广等优点，具有较高的临床应用价值。目前认为PCR与IHC评估肿瘤MSI状态具有高度一致性，近90%[14]；也有研究报道两者的一致性高达97.6%[15]。IHC检测肿瘤微卫星状态的灵敏度为91.1%，特异度为98.5%，可根据IHC结果决定是否进一步进行PCR检测，若4种修复蛋白均未表达，则可以判定为MSS，不需要进一步进行PCR检测，任一蛋白表达缺失则提示MSI[2]。另外，利用外周血进行基因测序也可以明确肿瘤患者的微卫星状态，但因价格昂贵，目前不作为常用的检测方法[14]。

4 MSI型胃癌的发生机制

散发胃癌和家族聚集性胃癌患者MSI的发生机制并不相同，大多数散发的MSI-H型胃癌中可观察到MLH1启动子区CpG岛的超甲基化[7,16-17]，在有胃癌家族史的患者中，遗传性dMMR可能是重要的MSI发生机制[4]。

在散发胃癌中，MSI-H与表观遗传调控有关。众所周知，微小RNA（microRNA，miRNA）在表观遗传调控中具有重要作用，研究发现，MSI-H和MSS均与miRNA的表达水平显著相关 ，包 括 miRNA-210、miRNA-196b、miRNA-203、miRNA-429、miRNA-200a、miRNA-105、miRNA-99a和has-let-7c[18-21]。miRNA-210和 miRNA-196b均是通过破坏DNA损伤修复基因的功能，导致MSI形成。miRNA-203可能通过定位毛细血管扩张性共济失调症突变基因（ataxia telangiectasia mutated，ATM）促进MSI-H的形成，而ATM在诱导DNA损伤信号和启动细胞周期检查点信号方面具有至关重要的作用[18]。miRNA-429和miRNA-200a是miRNA-200家族成员，在MSI-H型胃癌患者胃癌组织中的表达水平明显高于MSS型胃癌患者[18]，miRNA-200家族在促进胃癌细胞生长方面可能发挥重要作用[22]。与MSS型胃癌相比，miRNA-105、miRNA-99a和has-let-7c是在MSI-H型胃癌中表达下调最多的3个miRNA。很少有研究报道miRNA-105、miRNA-99a和has-let-7cs在胃癌中的作用。miRNA-99家族在胃癌中可能通过SNF2H来调节DNA损伤反应，其过表达可以抑制SNF2H的表达，降低DNA损伤修复率和整体修复效率[18]。

散发胃癌患者MSI的主要发生机制是MLH1基因启动子区域高甲基化，MLH1基因rs1800734G等位基因具有更高的转录因子结合活性和更低的MLH1基因启动子区域甲基化水平，该等位基因携带者具有更高的MLH1蛋白表达水平和更低的MSI发生率，相反MSH2基因rs2303428CC基因型具有增加MSI发生率的趋势。也有研究表明，rs1800734G等位基因在有胃癌家族史的患者中反而增加MSI的发生率，提示该等位基因的作用与胃癌家族史有关，其可能通过遗传性dMMR导致MSI的发生[4]。

还有研究表明，MSI型胃癌还可能与激活素A受体 2A（activin A receptor type 2A，ACVR2A）突变、磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）突变有关[23-24]。ACVR2A蛋白是一种跨膜受体，是转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的超级家庭成员，参与不同的生物过程，其活性信号通路在调节各种肿瘤细胞的分化、增殖和凋亡方面发挥了重要作用。ACVR2A基因位于2号染色体上，由11个外显子组成，在外显子3和外显子10上包含两个八聚腺苷DNA微卫星位点，这使得它极易在MSI-H型胃癌中发生突变。ACVR2A是MSI-H型胃癌中最常突变的基因，突变的ACVR2A与MSI-H具有显著关系[23]。PTEN突变导致MSI型胃癌发生的机制目前暂不明确，PTEN突变是MSI-H型胃癌中普遍的基因突变，PTEN突变可能导致DNA损伤修复失败，进而引起 MSI的发生[24]。

5 MSI型胃癌与饮食的关系

MSI型胃癌的发生风险与红肉和肉酱的消耗量呈正相关，与白肉的消耗量呈负相关，与总蛋白质和亚硝酸盐的摄入量也呈正相关，而与微量营养素的摄入量无关[25-26]。有学者提出吸烟和饮酒均与MLH1基因启动子高甲基化的胃癌有关，可能会影响MSI型胃癌的发展，蔬菜摄入量高、马铃薯摄入量低、hMLH1基因启动子高甲基化导致胃癌的发生风险增加[27]。谷胱甘肽S转移酶mu1（glutathione S-transferase mu 1，GSTM1）、谷胱甘肽S转移酶 θ1（glutathione S-transferase theta 1，GSTT1）、细胞色素P450家族成员1A1（cytochrome P450 fami-ly 1 subfamily A member 1，CYP1A1）、细胞色素P450家族成员2E1（cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1，CYP2E1）、醛脱氢酶2家族成员（aldehyde dehydrogenase 2 family member，ALDH2）、L-myc基因的多态性和大多数饮食因素不是MLH1启动子高甲基化胃癌的独立危险因素[2]。

6 MSI型胃癌与幽门螺杆菌（helicobacter pylori，HP）感染的关系

与非MSI型胃癌相比，MSI-H型胃癌患者中HP感染更为常见，HP阳性与MSI-H型胃癌的发生有关，这预示着HP在MSI-H型胃癌中可能影响了错配修复系统[9,11]。有研究在60例胃癌患者中发现了13例（21.7%）HP感染，包括3例MSI型胃癌患者[11]。HP感染会导致慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生、异型增生，最终诱导CIN型或MSI型胃癌形成，且HP感染会导致错配修复基因及蛋白表达下调，损害DNA错配修复途径[10]。将胃癌细胞与HP一起培养，发现错配修复蛋白及其mRNA水平降低，说明HP感染可能是通过降低错配修复蛋白的mRNA水平影响错配修复蛋白的表达，进而使胃黏膜细胞中突变累积，促进胃癌的发生。MLH1启动子甲基化可能与HP感染的持续时间有关，在HP根除后，胃黏膜中的错配修复蛋白表达增加，HP感染对错配修复蛋白表达的影响在其根除后部分可逆[10]。

7 MSI型胃癌与程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）的关系

MSI-H是针对程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）或其配体PD-L1的免疫治疗反应的潜在预测因素。PD-L1表达与MSI-H状态之间的关系仍然鲜为人知。大多数研究认为胃癌中MSI-H状态与PD-L1的高表达密切相关[13,16,28-30]。有研究调查了MSI-H型胃癌患者中PD-L1的表达情况，该研究分析78例MSI-H型胃癌患者胃癌组织中PD-L1的表达情况，PD-L1表达分为肿瘤细胞和免疫细胞上的表达，在48例（61.5%）胃癌患者的胃癌组织中观察到PD-L1表达，包括7例（9.0%）肿瘤细胞PD-L1表达和47例（60.3%）免疫细胞PD-L1表达[31]。另一项研究将肿瘤细胞中PD-L1的表达标记为PD-L1[T]，将肿瘤浸润免疫细胞中PD-1和PD-L1的表达分别标记为PD-1和PD-L1，结果发现，PD-1、PD-L1[T]和PD-L1在46例MSI型胃癌患者中的阳性表达率分别为59%、35%和57%，在169例MSS型胃癌患者中的阳性表达率分别为45%、22%和40%。统计分析表明，MSI型胃癌患者中PD-L1的阳性表达率高于MSS型胃癌患者（P=0.044）[30]。MSI型胃癌患者中T细胞和巨噬细胞高密度渗透，其中T细胞渗透占30%～50%，巨噬细胞渗透占20%，70%的MSI型胃癌患者表达PD-L1[22]。PD-L1表达与胃癌中高密度的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）和dMMR密切相关，dMMR导致肿瘤细胞积累频繁的基因突变，由于突变负荷过重，肿瘤细胞产生多种新抗原，引发T细胞活化和募集，表现出活跃的免疫微环境，导致多个免疫检查点蛋白（包括PD-1和PD-L1）表达显著增加[13,29-30]。另外，在MSI-H型胃癌中，观察到频繁的框移突变，包括ARID1A、RNF43、NF1、MSH6、BRD3、NCOA3、BCORL1、TNKS2和NPM1，框移突变的数量与PD-L1的表达也显著相关[32]。

8 MSI型胃癌与人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）蛋白表达的关系

hTERT作为端粒酶的调节亚单位，不仅对端粒酶的活性有一定的依赖和限制作用，而且对肿瘤的发展也具有重要作用。hTERT基因表达决定端粒酶的活性。端粒酶以自身的RNA为模板，可以连续合成新的端粒DNA序列（TTAG重复序列），这些序列被添加到染色体的末端，以补偿端粒损失并防止端粒缩短，从而保持基因稳定性。端粒功能障碍与各种肿瘤相关。胃癌和癌前病变患者中hTERT的表达水平随着端粒酶活性的增加而增加，且与肿瘤的分化程度有关，在分化不良的肿瘤中，hTERT表达水平较高。研究表明，hTERT和端粒酶活性增加可能与胃癌的发展有关，MSI与hTERT的表达呈负相关，在hTERT阳性患者中，MSS占71.9%（41/57），在hTERT阴性患者中，MSI占72.2%（13/18），MSS 占27.8%（5/18）[33]。该研究中，hTERT未在正常胃黏膜中表达，而在肠上皮化生、异型增生和胃癌中的表达逐渐增加。

9 MSI型胃癌的临床特点及预后

MSI型胃癌与老年、女性、远端位置、印戒细胞型、肠型、无神经浸润、无或少见淋巴结转移、浸润较浅、早期、脉管癌栓阳性、淋巴血管侵犯（lymphovascular invasion，LVI）、黏膜下浸润、肿瘤较大、腹膜受侵有关，且其复发率较低，预后良好，患者的生存率高[34-49]。

10 MSI对胃癌临床治疗的指导作用

目前胃癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗、免疫检查点抑制剂治疗和靶向治疗等，而MSI状态对胃癌临床治疗的指导作用主要涉及手术、化疗和免疫检查点抑制剂治疗3个方面。

通过复习文献发现，MSI-H型胃癌患者能够从免疫检查点抑制剂治疗中受益，原因可能是MSI-H型胃癌患者的体细胞突变频率增加、肿瘤抗原扩增、免疫原性增强，从而吸引大量TIL，表现出活跃的免疫微环境，加之免疫检查点分子普遍表达，因此使MSI-H型胃癌更易从免疫治疗中获益[50-54]。此外，遗传性MSI型胃癌较散发MSI型胃癌有更利于抗肿瘤免疫反应的肿瘤微环境，可能是因为前者的肿瘤微环境有助于3'-核酸修复外切酶1（three prime repair exonuclease 1，TREX1）基因发生突变，而该基因突变能够增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用[4]。基于此，MSI-H型进展期胃癌适合免疫治疗，甚至有研究提出辅助免疫治疗可能是比常规化疗更好的策略[52]。对于可切除的胃癌，MSI状态对早期胃癌的影响尚未得到彻底评估，MSI状态无法预测早期胃癌的预后，然而，早期MSI-H型胃癌中频繁出现LVI可能有助于指导患者的治疗，如内镜治疗或有限的淋巴结清扫。MSI状态对胃癌围手术期是否联合化疗的指导意义尚未达成一致看法，绝大多数研究认为，MSI-H型胃癌患者可能无法从围手术期化疗中受益（或可能获得不利影响），仅仅手术即可获益，可能的机制如下：MSI-H型胃癌的某些分子变化可能导致患者对化疗产生耐药，表观遗传变化[如骨形态发生蛋白 4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）的甲基化]与铂类耐药有关，MLH1启动子甲基化与接受奥沙利铂辅助化疗的胃癌患者的生存率低有关[35,48]。DNA靶向细胞毒性化疗会增加MSI型肿瘤的治疗抵抗，导致dMMR肿瘤的获得性耐药，这种情况可能会增加遗传的不稳定性，导致肿瘤细胞的异质性和侵袭性增强，因此，MSI-H/dMMR型胃癌患者的辅助化疗可在不降低肿瘤复发风险的情况下引起化疗抵抗，一旦复发则预后不佳[52]。MSI-H/dMMR型肿瘤与丰富的免疫细胞有关，这些细胞可能会在手术后抑制残留微转移，但是辅助化疗可诱导免疫抑制[51-52]。MSI型肿瘤具有淋巴细胞浸

润的特征，这有助于抗肿瘤免疫反应，而化疗的免疫抑制作用削弱了MSI型肿瘤的这一作用，完整的错配修复系统可以确保5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）在干扰DNA代谢之前有效地从DNA中消除，这也增加了药物的细胞内浓度，从而增加了MSS型患者的细胞毒性，而缺陷的错配修复系统可能减少了DNA修复，从而削弱了5-FU在MSI患者中的作用[9]。多数研究认为Ⅱ期和Ⅲ期MSI-H型胃癌预后良好，仅单独接受手术治疗即可[6,9,52,55]，也有研究认为Ⅲ期MSI-H型胃癌的围手术期化疗可使患者获得更好的生存获益[39-40]。因此，MSI与胃癌的关系仍有待讨论，需要更多的前瞻性研究来确定MRI状态对胃癌化疗反应的预测作用。

11 MSI表达的异质性

由于肿瘤的异质性，有研究者在同一胃癌患者中检测到MSI与MSS并存，约85%的原发肿瘤区域MSH2缺失表达，表现为MSI；5%～23%的原发肿瘤区域MSH2表达，表现为MSS；所检测的10个转移淋巴结中MSH2均表达，表现为MSS。MSS占原发肿瘤的5%～23%，只有这部分肿瘤扩散并转移到淋巴结[48]。这一结论进一步支持了MSI型胃癌的恶性程度较低并具有更好的生存预后的观点。微卫星状态异质性的原因尚不清楚，肿瘤细胞亚克隆中参与DNA甲基化调控和维持的基因突变是否可能助成这一现象，需要进一步研究[10]。

12 小结

综上所述，MSI型胃癌在临床中并不常见，患者多存在胃癌家族史，其发生机制与MLH1启动子区域CpG的超甲基化及dMMR有关，临床预后较好，Ⅱ期和Ⅲ期MSI-H型胃癌仅单独接受手术治疗即可，围手术期化疗可能不能给患者带来生存获益，甚至可能增加不必要的不良反应，MSI-H型胃癌因其独特的免疫微环境而能够从免疫检查点抑制剂治疗中获益，免疫检查点抑制剂有望成为MSI-H型胃癌围手术期治疗的新手段。