5-氮杂胞苷调节植物基因表达研究进展与应用展望

方学良，付 铭，陈 正，白云秀，何 莹，曾汉来

（农业农村部长江中下游作物生理生态与栽培重点实验室/华中农业大学植物科学与技术学院，武汉 430070）

0 引言

表观遗传学(epigenetics)是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达可遗传变化的一门遗传学分支学科。表观遗传现象广泛存在且类型较多，主要有核酸甲基化修饰、基因组印记(genomic imprinting)、母体效应 (maternal effects)、基 因 沉 默(gene silencing)、核仁显性、休眠转座子激活和RNA编辑(RNA editing)等。核酸甲基化修饰调控基因的表达是一种普遍存在的表观遗传现象，根据甲基化的对象和方式又分为DNA甲基化、RNA甲基化和组蛋白甲基化，甲基化修饰的位点及其修饰丰度均能参与基因的表达调控，从而改变生物的生长发育过程。DNA甲基化是指DNA复制过程后，通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)将 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)分子上的甲基(CH3-)基团转移到DNA的CpG序列的胞嘧啶上进行DNA甲基化修饰，一般可形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)、N6-甲基腺嘌呤(N6-mA)以及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。目前研究所关注的热点是胞嘧啶上的C-5上发生甲基化修饰形成5-mC。

5-氮杂胞苷(Azacitidine，5-Aza)是一种DNA甲基化抑制剂，其作用是能降低DNMTs的活性，从而使得甲基转移效率下降，使基因组的甲基化水平下降。近年来5-Aza在动物基因表达调节和医疗技术上有广泛的研究和应用，并直接作为肿瘤治疗剂进行临床应用。但在植物上的研究和应用相对滞后，仅有零星报道，从已有的文献也能说明5-Aza对植物基因组甲基化水平有抑制作用，并能调节植物的生长和生理特性。

1 DNA甲基化发生类型

DNA甲基化主要是DNA甲基转移酶作用下产生的结果，目前在植物中已知的模式有从头甲基化和维持甲基化2种。DNA甲基化主要发生在转座子(TEs)和重复序列，从而沉默这些区域的表达，具有稳定基因组的作用[1]。在一些特定区域的DNA甲基化也可以在有丝分裂或减数分裂中稳定遗传起到“胁迫记忆”的作用，这些胁迫记忆与细胞程序性死亡、发育或应激反应有关，可以帮助植物抵御持续的胁迫。DNA甲基化主要发生在3种序列当中，即对称序列CG、CHG和非对称序列CHG（H=A或C或T）[2]。不同物种之间全基因组甲基化水平也有所不同，模式植物拟南芥中测定总胞嘧啶甲基化水平为5%，而小麦胚芽中水平却高于20%，甲基化水平不同是重复序列的差异导致的[3]。

从头甲基化是指在甲基化转移酶的作用下将DNA链上未被甲基化的部分进行甲基化，在这个过程当中参与的DNA甲基转移酶是植物所特有的结构域重排酶(DRMs)，主要发生在非对称的序列CHH中。植物DNA从头甲基化的启动是通过RNA聚合酶Ⅱ的转录生产干扰RNA(siRNA)，依赖siRNA指导以及DRMs参与识别特异性位点且介导DNA甲基化发生。

维持甲基化是指发生甲基化的DNA通过半保留复制所产生的一条子链在相同的位置发生甲基化，所发生的甲基化位置与亲链相同。其主要发生在对称序列CG与CHG中出现，而甲基转移酶(METs)和染色质甲基转移酶(CMTs)参与这2个序列的甲基化活动[4]。CG甲基化的维持是由MET1起作用，而MET1突变体还有延迟花期的作用[5]，CMTs是维持CHG位点的DNA甲基化，它是植物特异性DNA甲基化酶。其家族有3个成员（MET1、MTE2和MET3），均参与维持CHG甲基化，MTE3的活性受H3K9me2甲基化转移酶(SUVH4)的活性水平决定，因此SUVH4也是维持CHG甲基化的一个重要蛋白[6]。

2 DNA甲基化水平的影响因素

植物在不同生长发育时期所处的调控状况不同，会响应不同发育行为，都取决于基因转录表达，因而不同发育时期的DNA甲基化水平变化在这个过程中发挥重要作用。植物不同发育阶段的DNA甲基化水平不同，在细胞增殖和分化过程中，DNA甲基化水平变化会导致细胞核内的DNA、RNA和蛋白质等生物大分子的分布重组。研究发现，在4℃预处理的大麦孢子重塑到胚胎发育以及花粉发育过程中，小孢子时期的DNA甲基化水平较低，DNA甲基化信号随着胚发育与分化过程逐渐增加[7]。通过对绿化树种马占相思(Acacia mangium)的全基因进行DNA甲基化测定发现，幼嫩组织和成熟组织间DNA甲基化水平存在差异，幼嫩叶片比成熟叶片的甲基化水平高1.7%[8]。对多种植物DNA甲基化与发育时期的关系研究发现，通常成年植株DNA甲基化水平比幼年植株要高，但也在一些植物上表现存在相反的结果，仍可说明DNA甲基化与植物发育进程是密切相关的。

环境因素可调控植物体内DNA甲基化水平，不同环境中植物体内DNA甲基化水平存在着差异。干旱会影响到植物正常的生理生化过程，可能会导致光合速率下降、渗透失调和细胞过氧化等。有研究表明，木材毛果样干旱时的DNA甲基化水平会产生变化，会导致许多干旱胁迫基因的表达模式改变。利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析，发现干旱胁迫显著增加芝麻DNA甲基化水平，比对照增加了11.44%，当胁迫解除后甲基化水平也逐渐恢复到对照的水平[9]。也有研究发现2个芥菜品种(RH30、RSPR01)在干旱时，整体的甲基化水平会出现下降的趋势[10]。

温度是制约作物产量与品质的主要环境因素之一，高温和低温都会造成一定程度减产。在高温胁迫下通过表观遗传学可以调控热响应基因的表达，有研究表明热胁迫会诱导抗性基因的甲基化水平改变[11]。有研究发现，油菜在热胁迫下22个DNA甲基化酶相关的基因表达量出现显著改变[12]。苹果在不同程度低温胁迫下，总甲基化百分比随低温不同而发生变化，而基因表达量也存在差异，推断甲基化变化与施加的低温是存在相关性的，其有可能调控苹果的表观遗传[13]。低温处理会改变玉米的甲基化水平，在幼苗的根部检测到低的甲基化，甲基化水平从38.4%下降到24.7%，说明低温造成了甲基化水平下降[14]。模式植物拟南芥受到低温处理后甲基化水平下降了22%，表明低温可导致去甲基化[15]。不同环境下DNA甲基化水平存在差异，有可能参与一个或多个生物调节途径，需要更加深入的探索。

化学物质可以调控DNA甲基化水平，不同化学物质所导致的结果存在差异，存在正向调节与负向调节。姜科植物中的姜黄素可以使DNA甲基化水平降低15%～20%[16]，其化学结构与胞嘧啶和5-Aza类似。绿茶中的茶多酚和生物黄酮都能调控DNA甲基化水平，它们主要对DNMTs的活性起到抑制作用，也抑制DNMTs基因表达[17]。观赏植物小白菊的主要成分倍半萜内酯可以被烷基化，结构发生改变影响转录因子Sp1的转移效率，使DNMT1相关的Sp1的数量减少，降低DNMT1活性，从而降低DNA甲基化水平[18]。中药砒霜中的主要成分三氧化二砷则可以通过提高自发性狼疮小鼠脾脏单个核细胞DNMT1相关基因表达水平来提升DNA甲基化水平[19]。以上研究表明，DNA甲基化水平可以被多种化学物质调控，为研究甲基化机理提供了更多的途径。

3 DNA甲基化对植物基因表达水平的调节作用

以往许多研究都提出了一个观点，DNA甲基化水平与基因表达呈负相关[20-21]。启动子区域的甲基化，能通过阻止转录激活因子的结合而直接抑制转录起始或者通过调控组蛋白修饰间接抑制转录[22]。深入研究发现，并非所有的启动子甲基化都能抑制转录，部分基因转录对启动子甲基化水平并不敏感。对植物的一项研究发现，在327种转录因子中，24%转录因子不受甲基化抑制或受甲基化抑制作用较弱[23]。另有研究发现甲基化的启动子对基因转录有促进作用，这些转录因子往往具有甲基结合域(methyl-binding domain，MBD)，能特异性识别特定甲基化的启动子[24]。转座子会以高度甲基化来维持基因组稳定性，在拟南芥中转座子也存在于染色体上基因富集的区域，有研究认为这种DNA甲基化对转录的激活效应是植物中一种避免转座子高度甲基化给邻近基因带来沉默的机制[25]。转录调控与DNA甲基化之间的关系，有人提出DNA甲基化是转录调控的结果而不是原因，发现转录因子能招募甲基转移酶使DNA甲基化[24]，而转录因子对DNA甲基化的调控也有相关论述[26]。

启动子甲基化对基因表达有重要调控作用，但在拟南芥中，只有大约5%的基因在启动子区域被甲基化[22]，而超过1/3的基因本体被甲基化[27]。基因本体甲基化中，绝大多数为CG甲基化，CHH、CHG甲基化模式占比极少，并且外显子中甲基化程度大于内含子，而转录起始位点和终止位点的甲基化相对较少[28]。基因本体的甲基化作用有抑制转录延伸[29]、调控可变启动子[30]、抑制基因内异常转录启动[31-32]几种观点。基因内异常转录的抑制作用与一项研究[33]结果相吻合，异常转录还与组蛋白修饰有关[34]。基因本体的甲基化对基因表达稳定性具有调控作用，对一种能孤雌生殖的小龙虾（美洲龙纹螯虾，Procambarus virginalis）的研究显示，基因本体甲基化与染色质可及性和基因表达稳定性相关，甲基化水平低的基因往往具有较高的染色质可及性和基因表达的变异性，这也证实了管家基因本体中较高的甲基化水平的原因[35]。基因本体的甲基化水平与染色质可及性之间相关性可能与组蛋白H1在CG序列区域富集有关，基因本体上CG往往被甲基化，可是染色质可及性似乎又和基因表达没有直接关系，组蛋白H1突变体的异染色质本身变得更松散，功能上却没有改变[32]，表明基因本体的甲基化对基因表达稳定性的调控或许还有除染色质可及性以外的途径。在人的骨骼肌细胞中，外显子CG甲基化有利于转录[36]，而在植物中，第6外显子CG的甲基化反而抑制叶片远轴决定基因ETT/ARF3的表达[37]。对8种禾本科植物DNA甲基化的研究表明，基因本体的CG甲基化在进化上比较保守[38]，基因本体的甲基化功能还需进一步的研究来阐明机制。

4 DNA去甲基化

DNA去甲基化可以将基因从沉默状态激活。DNA去甲基化存在被动去甲基化和主动去甲基化2种模式。被动去甲基化主要是在DNA复制过程中，半保留的复制方式中依赖甲基转移酶活性，酶的活性受到抑制或者含量偏低时，使新链中本该甲基化的位点未发生甲基化，从而造成甲基化水平降低的模式。主动去甲基化是由DNA糖基化酶/裂解酶参与的特殊酶促反应，植物基因组上的5-mC可以由DNA糖基化酶等剪切[39]，之后通过碱基互补配对原则形成一个新的未被甲基化的位点，从而降低基因组的DNA甲基化水平的一种DNA去甲基化模式。

5 DNA甲基化抑制剂

DNA甲基化抑制剂主要作用都是在代谢过程中与DNMTs结合，从而降低酶的活性，阻碍甲基化进程，达到降低甲基化水平的效应。DNMTs抑制剂主要包括核苷类和非核苷类2类，目前已报道的有5-氮杂胞苷（阿扎胞苷，Azacitidine，5-Aza）、5-氮杂脱氧胞苷（地西他滨，5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-dc）、折布拉林(zebularine)、法扎拉滨(fazarabine)、氨基苯甲酸类（普鲁卡因、普鲁卡因胺）、茶多酚类（表没食子儿茶素没食子酯酸）、肼类（肼屈嗪）、邻苯二酰胺类(RG108)、反义寡核苷酸类(MG98)、三氧化二砷(Arsenic trioxide)等都具有抑制DNMTs的作用。

目前的研究热点主要集中在核苷类，它可以作为一种肿瘤治疗剂被广泛研究。核苷类抑制剂有5-Aza和5-Aza-dc，进入体内可随机掺入到DNA链中，其嘧啶环上的第5位氮原子无法结合甲基实现去甲基化，从而恢复某些关键抑癌基因或DNA修复基因的转录活性。同时，DNMTs会结合5-Aza-dc和SAM的甲基基团形成一个稳定的共价复合体，但不能完成甲基化转移的催化反应，使DNMTs的甲基转移效率整体下降，从而降低全基因组的甲基化水平。5-Aza和5-Azadc在细胞内的作用对象有所差别，前者主要作用于RNA，部分作用于DNA的甲基化抑制；而后者主要以形成磷酸盐的方式对DNA进行甲基化抑制作用。已有研究表明，低剂量、低毒性的DNA甲基化抑制剂5-Aza和5-Aza-dc[40]治疗血液肿瘤是有效的。其不同于传统化疗药物，低浓度的药物剂量可降低细胞内DNMTs表达，使基因的甲基化程度降低，并不直接导致细胞死亡，而是通过重新活化被甲基化沉默的抑癌基因，从而促进肿瘤细胞凋亡[41]。近年来关于5-Aza的应用研究开始成为热点，其作为一种甲基化抑制剂在植物上的应用也开始备受到关注。

6 5-Aza对植物基因表达的调节与应用效果

近年的研究表明，5-Aza对植物的DNA甲基化同样具有抑制作用，可以有效调控植物基因组的甲基化水平，并使植物随甲基化水平的变化表现出性状上的效应。已有研究表明，5-Aza对棉花、小麦、水稻和玉米等多种植物的生长发育、逆境胁迫、生殖生长、光合作用和品质性状等均有调节作用，预示其在植物上将有广泛的潜在应用价值。部分相关研究实例见表1。

表1 5-Aza对植物的调节效应研究进展

7 展望

随着甲基化检测技术的更新换代，甲基化检测技术从甲基敏感酶进行核酸杂交(Southern blotting)与酶切PCR(CHOP PCR)检测、染色质免疫共沉淀序列分析(ChP-seq)，发展到如今广泛使用的全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome heavy sulfite sequencing)技术，为甲基化位点确定提供了更加精准的检测技术。生物多组学数据库和生物信息学分析方法在不断完善和发展中，使整体甲基化水平与单个甲基化位点的生物学功能分析更加准确。5-Aza作为一种DNA甲基化抑制剂，为动物肿瘤、骨质增生等疾病的治疗提供了新的医治途径，提高了靶向治疗准确性和治愈效果。在植物方面可以调控生长发育和抗逆性、提高植物愈伤组织分化和再生能力、能促进花器官发育提高花粉育性和结实率等效应，已表现出潜在的应用前景。

DNA甲基化抑制剂在植物生长调节上的研究目前还是处于起始阶段，需要加强基础研究和应用技术研发，确定5-Aza安全合理的使用剂量与使用时期、减弱或消除毒害作用、改进施用方式，还需深入探索其对基因调控的作用机理。应用基因组学、转录组学、蛋白组学以及代谢组学联合分析5-Aza的作用靶标基因及其调控网络，从基因表达与代谢调节层次上解析5-Aza的处理效应，为作物品种改良和栽培调节提供表观遗传修饰方面的理论依据与应用技术。