维甲酸/干扰素联合诱导的细胞凋亡相关基因-19在恶性肿瘤中的研究进展

王瑞，陈斯泰

1泰州市人民医院皮肤科，江苏 泰州 225300

2大连医科大学研究生院，辽宁 大连 116044

维甲酸/干扰素联合诱导的细胞凋亡相关基因-19（gene associate with retinoid/interferon induced mortality-19，GRIM-19）是由干扰素、维甲酸联合诱导表达的细胞凋亡调节基因，最早由Angell于2000年从β-干扰素和维甲酸诱导的细胞凋亡途径中筛选分离出来[1]。研究表明，GRIM-19不仅通过与多种因子相互作用参与炎症因子相关的病理生理过程，而且在肿瘤细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭等方面发挥了重要作用[2]。本文就GRIM-19在恶性肿瘤中的研究进展进行综述。

1 GRIM-19概述

细胞凋亡是抑制细胞增殖、维持组织内环境平衡的重要生物学过程，多种细胞因子以多种形式参与诱导细胞凋亡。鉴于干扰素具有多效抗肿瘤作用，早在19世纪末期便被应用于肿瘤的治疗中；维甲酸在早期治疗白血病等肿瘤性疾病和抑制异常细胞增殖的过程中也取得了较好的效果[3-4]。2000年，美国学者Angell所在团队在探究干扰素及维甲酸诱导细胞死亡的分子生物学机制的过程中，发现干扰素和维甲酸联合应用可显著抑制肿瘤细胞生长，因此该团队通过反义基因敲除技术成功分离并鉴定了GRIM-19，在后续实验中发现GRIM-19的反义表达可通过降低细胞内GRIM-19蛋白水平而抑制干扰素及维甲酸联合诱导的细胞凋亡，而上调GRIM-19的表达可使肿瘤细胞死亡，进一步证实了GRIM-19的促凋亡作用[1]。GRIM-19位于人19p13.2染色体上，含有552个碱基对，编码16 kD的多肽，该多肽被认为是一种可促进细胞凋亡的核蛋白。后续研究发现，GRIM-19是线粒体电子传递链复合物Ⅰ的关键组成部分之一，不仅能确保线粒体氧化磷酸化过程的完整性，还参与了线粒体相关的细胞凋亡过程[5]。当GRIM-19基因下调时，线粒体的产能供能效应会受到影响，异常氧化应激会导致肿瘤细胞异常增殖及侵袭，这在一定程度上解释了上调GRIM-19对肿瘤具有抑制作用[6]。GRIM-19在真核生物中高度保守，其亚细胞定位主要在细胞质线粒体中，在部分细胞的细胞核中也可发现GRIM-19，其在人体组织中的表达水平与线粒体丰度相关，因此其在人骨骼肌组织、心脏组织中的表达水平相对较高，而在胎盘、肝组织、肾组织中的表达水平相对较低[7]。GRIM-19不仅在自身免疫、先天免疫、胚胎发育、脂质代谢、糖类代谢、细菌及病毒感染等多种生物学反应中具有调节作用，还能通过多种方式抑制肿瘤细胞的增殖和生长。

2 GRIM-19促进细胞凋亡

信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）是一种多结构域蛋白，作为恶性肿瘤中组成性激活的重要转录因子之一，在细胞增殖、分化、存活和细胞因子诱导的信号反应等生物学过程中发挥着重要作用[8]。有学者通过酵母双杂交技术发现GRIM-19对STAT3的活性具有负性调节作用，GRIM-19作用于STAT3的转录激活结构域，通过与该区域特异性结合，使STAT3及其下游基因的转录和翻译受到影响，以此相互作用抑制STAT3依赖性基因的表达。因此，GRIM-19被认为是STAT3的抑制剂，未来可能作为抗肿瘤治疗的有效靶点[9]。此外，GRIM-19还能通过表皮生长因子抑制STAT3核转位的兴奋性，从而阻断STAT3的复制及下游基因的表达。GRIM-19的促凋亡作用不仅受STAT3的影响，其组成活性还与细胞周期蛋白（cyclin）B1、转录因子 Dp-1（transcription factor Dp-1，TFDP1）、细胞生长促进因子（如cyclin D1、c-Myc）、基质金属蛋白酶家族的促转移成员、髓细胞白血病因子1（myeloid cell leukemia 1，MCL1）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）等抗凋亡调节因子有关，上述因子均参与了肿瘤的发生和发展。GRIM-19还通过Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）、丝裂原活化的蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）、胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）等其他信号通路参与肿瘤的调控。

3 GRIM-19在恶性肿瘤中的研究

3.1 GRIM-19与胃癌

胃癌是全球第五大常见的恶性肿瘤，也是第三大常见的恶性肿瘤死亡原因[10]。Huang等[11]研究检测了60例胃癌组织及癌旁正常组织中GRIM-19的转录水平，结果发现，与癌旁正常组织相比，胃癌组织中GRIM-19mRNA表达水平显著降低。免疫组化染色发现，胃癌组织中GRIM-19蛋白表达显著降低，而在正常组织中GRIM-19表达水平较高，说明GRIM-19的表达与胃癌细胞的增殖潜能相关。GRIM-19缺失与侵袭性病理特征存在显著关系，提示GRIM-19缺失与不良临床结局有关，GRIM-19可能作为胃癌的预后标志物。应用含GRIM-19片段的重组质粒对胃癌细胞进行转染，发现GRIM-19对胃癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，说明GRIM-19在胃癌中具有肿瘤抑制作用。Wang等[6]通过在线数据库对胃癌组织中GRIM-19mRNA的表达水平进行分析，结果发现，与非肿瘤组织相比，原发性胃癌组织中GRIM-19mRNA表达显著降低。在此基础上，该团队构建体外实验及动物模型，探究GRIM-19缺失对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果发现，GRIM-19缺失显著增强了胃癌细胞的迁移和侵袭能力，GRIM-19表达下调对于远处肺和肝转移具有促进作用，GRIM-19表达缺失加速了胃癌的远处转移。当GRIM-19基因表达下调时，线粒体的产能供能效应会受到影响，异常氧化应激使线粒体内活性氧含量增高，从而使肿瘤细胞增殖失控、侵袭性增强。使用抗氧化剂处理能够显著消除GRIM-19缺失驱动的细胞迁移和侵袭，这说明GRIM-19低表达导致的活性氧异常增多促进了胃癌的转移。

3.2 GRIM-19与肺癌

Fan等[12]研究对16例肺鳞状细胞癌、15例肺腺癌、10例小细胞肺癌及10例肺炎患者的肺部组织进行免疫组化染色，结果发现，GRIM-19在肺癌组织中的表达水平显著低于肺炎组织，小细胞肺癌中GRIM-19的表达相较于肺鳞状细胞癌及肺腺癌显著缺失。在小细胞肺癌中，临床分期越高，GRIM-19表达越低，说明GRIM-19在不同临床分期的肿瘤中可能存在表达差异。另有研究者采用免疫组化法检测67例非小细胞肺癌患者肿瘤组织及癌旁正常组织中GRIM-19的表达情况，结果显示，肿瘤组织、癌旁正常组织中GRIM-19阳性表达率分别为53.7%、89.7%，差异有统计学意义（P＜0.05）；Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期非小细胞肺癌患者肿瘤组织中GRIM-19阳性表达率分别为65.1%、33.3%，差异有统计学意义（P＜0.05）[13]。说明GRIM-19低表达与非小细胞肺癌的发生及临床分期有关，GRIM-19的表达随着非小细胞肺癌恶性程度的升高而下降。

3.3 GRIM-19与卵巢癌

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，也是全球最常见的恶性肿瘤死亡原因之一，患者的5年生存率低于45%，其具有较高的复发性且易耐药，因此，寻找有价值的预后标志物可为治疗方案的制订提供依据[14]。Ilelis等[15]通过对Ⅲ～Ⅳ期高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer，HGSOC）患者手术切除的肿瘤组织及癌旁正常组织进行免疫组化检测，评估GRIM-19、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和核因子κB激酶抑制剂B亚基（inhibitor of nuclear factor kappa B kinase beta subunit，IKK2）的表达水平及与化疗反应的关系，结果发现，IKK2、NF-κB表达与预后有关，是HGSOC铂类化疗反应的潜在预测因子，GRIM-19是HGSOC预后和疾病复发的潜在预测因子，较高的GRIM-19表达水平与较低的复发率和较高的总生存率相关，在复发HGSOC中，GRIM-19高表达可能是良性预后的标志。Wang等[16]采用免疫荧光法检测STAT3和GRIM-19在上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）中的亚细胞定位，观察到STAT3和GRIM-19主要位于细胞质中，GRIM-19与线粒体存在明显的共定位现象，少量的STAT3蛋白在细胞核中表达。采用免疫组化链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）法对不同卵巢组织中STAT3和GRIM-19的表达水平进行检测，发现STAT3在卵巢恶性肿瘤、交界性肿瘤、良性肿瘤和正常卵巢中的表达依次递减，而GRIM-19的表达依次递增。GRIM-19的表达水平随着疾病进展呈下降趋势，STAT3则相反，GRIM-19在卵巢组织中的表达与STAT3呈负相关，GRIM-19低表达与疾病进展有关。

3.4 GRIM-19与肝癌

据统计，全球约半数的肝癌发生在中国[17]。流行病学调查显示，到2025年，全球将有超过100万人罹患肝癌[18]。Kong等[19]采用免疫组化法评估GRIM-19在肝癌组织和癌旁非肿瘤肝组织中的表达情况，同时用表达GRIM-19的慢病毒质粒转染细胞，通过半定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和免疫印迹法检测GRIM-19mRNA和GRIM-19蛋白的表达，采用噻唑蓝法和流式细胞仪检测细胞增殖情况，结果发现，GRIM-19蛋白在癌旁非肿瘤肝组织中高表达，在肝癌组织中低表达，GRIM-19低表达可促进肿瘤侵袭和转移，GRIM-19表达上调对肿瘤具有抑制作用，GRIM-19在肝癌中的过表达能够明显抑制细胞周期，促进肿瘤细胞凋亡。另有学者通过构建体内外实验模型检测GRIM-19对肝癌细胞生长增殖能力的影响，结果发现，GRIM-19对肝癌细胞具有明显的抑制作用，且GRIM-19蛋白浓度越高，对肝癌细胞的生长抑制作用越强；给予不同浓度GRIM-19蛋白注射并对瘤重进行对比，发现GRIM-19蛋白处理组的瘤重与对照组相比显著降低，GRIM-19对肝癌细胞的增殖具有抑制作用，这一结论证实了GRIM-19作为细胞凋亡基因能够抑制肝癌生长，GRIM-19低表达能够促进肝癌的增殖及转移[20]。

3.5 GRIM-19与肾细胞癌

透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）占全部肾细胞癌的80%，在所有泌尿系统肿瘤中病死率最高[21]。Yan等[22]研究筛选了93例配对的ccRCC组织及癌旁正常组织，对38例成对手术组织进行液氮快速冷冻，采用实时定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）和西方墨点法分析GRIM-19mRNA水平的变化情况，发现GRIM-19表达与肿瘤T分期和Fuhrman分级呈负相关。西方墨点法显示，相对于癌旁正常组织，GRIM-19蛋白表达在相应的肿瘤组织中普遍被抑制，GRIM-19蛋白表达与其mRNA呈正相关，且蛋白质水平的下调与肿瘤分期和Fuhrman分级的增加有关。免疫组化染色显示，GRIM-19在正常肾上皮细胞和肾小管、集合管上皮细胞中高表达，未观察到其在肾小球细胞核着色，GRIM-19低表达与肿瘤分期和Fuhrman分级的增加均有关。该发现与qRT-PCR和西方墨点法的结果一致。

3.6 GRIM-19与结直肠癌

内化NGR（internalizing Asn-Gly-Arg，iNGR）是一种肿瘤穿透肽，通过结合在肿瘤细胞上大量表达的细胞表面蛋白CD13将生物分子递送至细胞。Pang等[23]构建了iNGR-GRIM-19融合蛋白，并测试了其在体外培养的结直肠癌细胞和体内异种移植裸鼠中的肿瘤靶向性和肿瘤抑制效果。该研究发现，iNGR-GRIM-19融合蛋白能够抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭，并促进结直肠癌细胞凋亡，该研究还表明GRIM-19过表达对肿瘤细胞的侵袭和迁移具有抑制作用。Zhang等[24]对比了不同类型结直肠癌细胞与正常结直肠上皮细胞中GRIM-19的表达，结果发现，GRIM-19在结直肠癌细胞系中显著下调。缺氧在肿瘤转移和上皮-间充质转化过程中具有至关重要的作用，自噬是缺氧导致的应激反应之一。通过将肿瘤细胞置于缺氧环境下，并测定细胞活力，发现在缺氧刺激下，GRIM-19过表达可导致结直肠癌细胞的侵袭能力显著降低，低氧诱导的自噬可被GRIM-19逆转。缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1α在肿瘤进展、治疗抵抗、侵袭和转移中具有重要作用，GRIM-19的过表达减弱了HIF-1α的积累[25-26]。GRIM-19能够抑制STAT3的磷酸化和转录活性，从而阻断STAT3信号通路。缺氧条件下，GRIM-19能够抑制下游靶HIF-1α的激活，靶HIF-1α能够抑制自噬，从而促进结直肠癌细胞的侵袭和上皮-间充质转化。总之，GRIM-19/HIF-1α/STAT3信号通路能够抑制缺氧环境中的肿瘤侵袭和上皮-间充质转化，GRIM-19过表达为结直肠癌的治疗提供了一种新的治疗策略。

3.7 GRIM-19与前列腺癌

有研究者采用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测前列腺癌组织和正常前列腺组织中微小RNA（microRNA，miRNA）-423-5p和GRIM-19的表达，发现miRNA-423-5p在人前列腺癌细胞中的表达水平显著高于正常前列腺组织和前列腺上皮细胞，而GRIM-19在人前列腺癌细胞中的表达水平较低。进一步采用噻唑蓝法、流式细胞仪检测，发现GRIM-19是miRNA-423-5p的靶蛋白。miRNA-423-5p敲除破坏了二者间的反馈作用，导致GRIM-19表达上调，从而抑制肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡[27]。

3.8 GRIM-19与皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）

CSCC起源于表皮或附属器的角质形成细胞，是非黑色素瘤皮肤癌中发生率仅次于基底细胞癌的恶性皮肤肿瘤，多种通路在其侵袭性进展中发挥作用，GRIM-19与STAT3的相互作用可能是导致CSCC进展的原因。研究显示，GRIM-19在正常皮肤组织中呈阳性表达，在高分化、中分化和低分化CSCC中表达逐渐减弱，STAT3在正常皮肤组织中不表达，随着CSCC恶性程度的增加，其表达水平逐渐升高[28]。另有研究者采用携带GRIM-19的质粒转染头颈部CSCC细胞，发现上调GRIM-19的表达可以显著抑制头颈部CSCC细胞的增殖、侵袭及迁移[29]。有学者采用PCR和蛋白质印迹法检测了GRIM-19在CSCC细胞系中的表达情况，结果发现，GRIM-19的转录及翻译水平均较低。上调GRIM-19的表达对CSCC细胞的增殖和侵袭具有抑制作用，而敲除GRIM-19促进了肿瘤细胞的增殖和迁移。此外，GRIM-19的过表达不仅对STAT3的磷酸化和转录活性具有抑制作用，对STAT3靶基因的表达也存在负性调控，GRIM-19过表达能够抑制与STAT3信号下调相关的CSCC的增殖和侵袭[30]。

4 小结与展望

GRIM-19低表达与多种恶性肿瘤的侵袭及转移有关，其在肿瘤的进展中具有重要作用。通过技术手段将外源性GRIM-19导入肿瘤细胞可抑制肿瘤细胞的侵袭及转移，从而导致肿瘤细胞凋亡。因此，GRIM-19可能成为肿瘤的潜在治疗靶点，以GRIM-19为基础靶向治疗肿瘤可能是未来的研究方向。然而，GRIM-19在信号通路中的作用、与其他凋亡基因的关系及相互作用、对相关因子的调控及缺失表达后的替代机制等仍需进一步研究。