基于GC-MS的良恶性腹水患者代谢组学差异分析*

唐 杰，殷晨燕，许尤琪△

1.江苏省第二中医院/南京中医药大学第二附属医院肿瘤科，江苏南京 210017；2.江苏省中医院药剂科，江苏南京 210029

腹水的病因复杂，可分为良性和恶性，主要表现为胸闷、憋气或腹胀等，但临床上对腹水的病因诊断存在较大的难度，如何准确有效鉴别腹水性质对临床诊治具有重要的意义[1]。代谢组学是一种新型组学技术，可检测代谢物的转化与水平变化，有利于发现疾病相关的代谢通路及潜在靶标、作用位点，从而为临床诊治提供重要的依据[2]。而气-液相质谱(GC-MS)是代谢组学常用的检测方法，可发现肿瘤组织及癌旁组织间的代谢差异，有利于了解肿瘤发生、发展情况，为临床诊治寻找潜在靶点，但目前关于良恶性腹水代谢组学差异的研究较少[3]。本研究通过GC-MS检测良恶性腹水患者代谢情况，寻找二者的代谢组学差异，以期为临床诊治提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年6月至2021年6月江苏省第二中医院收治的58例恶性腹水患者作为恶性组，其中男30例，女28例；年龄20～74岁，平均(47.62±7.85)岁；体质量指数17.65～28.98 kg/m2，平均(22.71±2.68)kg/m2；腹水病因：肝癌28例，胃癌14例，肠癌10例，胆管癌6例。另选取同期收治的58例良性腹水患者作为良性组，其中男34例，女24例；年龄21～73岁，平均(46.92±7.67)岁；体质量指数17.82～28.65 kg/m2，平均(22.53±2.59)kg/m2；腹水病因：肝硬化28例，胃肠道疾病18例了，结核性腹膜炎12例。纳入标准：(1)均经临床症状、病史、实验室、病理学等检查确定腹水的良恶性；(2)年龄>18岁，无精神病病史；(3)所有患者均签署知情同意书。排除标准：(1)有糖尿病等原发性代谢性疾病；(2)孕产妇或哺乳期；(3)检查前3个月内有免疫、激素、放化疗等治疗史。两组性别、年龄、体质量指数差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经江苏省第二中医院伦理学委员会批准。

1.2方法

1.2.1主要仪器与试剂 Agilent 6890/5975B气相色谱-质谱联用仪、DB-5 MS气相毛细管色谱柱、Milli-Q Gradient超纯水系统购自美国Agilent科技有限公司，低温冷冻冰箱、样品浓缩仪购自英国Stuart公司，微型漩涡混合器、高速冷冻离心机购自美国Millipore中国有限公司，数控超声仪、箱式电阻炉、烘箱购自上海福玛实验设备有限公司。甲氧胺、N-O-双(三甲硅基)三氟乙酰胺、L-2-氯苯丙氨酸、十七酸购自美国Sigma-Aldrich 公司，甲醇、氯仿购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2.2标本采集及处理 治疗前对患者行腹腔穿刺，抽取10 mL腹水并置入已编号的冻存管，迅速投入液氮罐内低温保存、备用。检测前统一解冻处理腹水标本，加入3倍量生理盐水匀浆，加500 μL甲醇涡旋1 min，置-20 ℃冰箱沉淀蛋白后离心10 min(12 000 r/min，4 ℃)；取200 μL上清液氮气吹干，加入15 mg/mL甲氧胺80 μL振荡30 s，摇床(250 r/min，30 ℃)中行甲氧胺对羰基的封闭反应1.5 h，再加80 μL的双(三甲基硅基)三氟乙酰胺振荡30 s，70 ℃烘箱中放置1 h，室温中放置1 h后待用。

1.2.3GC-MS检测 取1 μL标本行GC-MS分析，设质谱参数[电子碰撞电离电压70 eV，四级杆温度150 ℃，离子源温度230 ℃，溶剂延迟5 min，质谱全扫描范围30～600质荷比(m/z)，方式为全扫描]，设液相色谱参数(色谱柱DB-5MS毛细管柱，进样量1.0 μL，进样口温度270 ℃，接口温度260 ℃，载气99.999%纯氦，流速1.0 mL/min，进样方式为不分流)，色谱柱程序升温检测。

1.3统计学处理 (1)数据处理。所有原始数据经自带Agilent MSD工作站转化为Net CDF后导入R软件行XCMS工具箱处理，最终形成由标本名称、峰指数(保留时间-质荷比)、峰面积组成的三维矩阵表。(2)模式识别。三维矩阵表导入SIMCA-P11.5(Umetrics,Umea,Sweden)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析法(PLS-DA)处理，采用正交偏最小二乘法判别分析法(OPLS-DA)来寻找差异变量，以变量对模型的重要性(VIP，VIP值越大说明贡献越大)>1.0选择多维统计上的差异变量进行验证。采用7次交叉验证和影响排列检验(RPT)对所得差异性代谢物的多维统计结果进行验证，以VIP>1.0和P<0.05，结合错误发现率检验的q<0.05确定最终差异性代谢物。(3)代谢通路分析。依据多维统计给出的差异变量检索美国国家标准与技术研究院(NIST)数据库得到对应的化合物，用标准品鉴定差异表达代谢物，最后检索京都基因与基因组百科全书(KEGG)库和人类代谢组数据库(HMDB)得到对应的代谢通路，并通过基础代谢库确定[4-5]。

2 结 果

2.1两组腹水代谢物检测结果比较 离子流色谱图显示恶性组和良性组腹水中均检测到多种代谢物(每个峰代表≥1个代谢物)，见图1。

注：A为恶性组腹水离子流色谱图；B为良性组离子流色谱图。图1 两组腹水患者离子流色谱图比较

2.2两组代谢模式比较 PCA图(图2A)显示良性组和恶性组质控标本集中、稳定性好、可靠性高，两组标本多位于95%置信区间的椭圆范围内，显示两组代谢差异显著并区分明显；OPLS-DA图(图2B)显示，良性组和恶性组代谢差异显著分离(升高)；OPLS-DA载荷图(图2C)显示，两组均有大量代表代谢物的圆点且靠近两边三角形，即两组间有大量差异性代谢物且差异显著；7次交叉验证结果显示，两组OPLS-DA模型中，R2X=0.28，R2Y=0.96，Q2=0.92，说明模型具有较好的稳定性和可靠性；OPLS-DA的RPT图(图2D)显示，两组OPLS-DA模型经200次随机排列计算后，显示右侧的点均高于左侧相同形状的点，累积Q2=0.39，模型稳定可靠。

注：A为PCA图；B为OPLS-DA图；C为OPLS-DA载荷图；D为OPLS-DA的RPT图。图2 两组腹水患者代谢模式比较

2.3两组差异性代谢物分析 OPLS-DA滤除噪音后，以第一主成分的VIP值(阈值>1)、P值及其校正的q值确定非差异性代谢物有13个，差异性代谢物有34个(q<0.05)，见表1。

表1 两组代谢物分析

续表1 两组代谢物分析

2.4两组差异性代谢物的代谢通路筛选 将差异性代谢物通过KEGG库映射获得与之相关的代谢通路，经超几何分布统计，其中谷氨酸和谷氨酰胺(L-谷氨酸、L-谷氨酰胺)、半乳糖(D-果糖、D-半乳糖、甘露糖、葡萄糖、D-半乳糖酸)、磷酸戊糖(葡萄糖酸内酯、葡萄糖、核糖、氨基葡萄糖)及谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸(L-天冬氨酸、L-谷氨酸、N-乙酰-L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺)4条代谢通路的代谢物在两组间差异有统计学意义(P=1.35×10-3、3.86×10-3、2.06×10-2、1.29×10-3)，见表2。

表2 两组代谢物的代谢通路分析

3 讨 论

与良性腹水比较，恶性腹水因癌细胞已失去正常细胞的生理功能，其异常快速生长的特性会引起机体多项生命活动异常[6-7]。据相关研究报道，癌细胞会导致糖代谢、脂肪代谢、嘌呤嘧啶代谢等代谢异常的发生[8-9]，如Warburg效应，即正常细胞会借助线粒体产生的腺苷三磷酸来获取能量，癌细胞则靠糖酵解作用为自身提供能量及生长所需的代谢物，癌组织糖酵解率可达正常组织的200倍，提示了解相关代谢途径有助于深入了解癌症发生、发展机制，并可促进新的诊治方法出现[10-11]。

代谢组学通过以高分辨率分析仪和多维统计的方法分析细胞、组织或体内的代谢物全局性来揭示生命活动，可反映生物机体在受到外界干扰时机体的应答反应，从而了解疾病发生机制和药物作用机制[12-13]。有研究报道，GC-MS是代谢组学中应用较广的技术，可对组织、大便、体液等样品中的小分子物质进行分离、检测和定量，从而发现生理状况下的代谢物的变化情况[14-15]。本研究PCA显示，恶性组和良性组的代谢轮廓有显著性差异，表明良恶性腹水患者存在代谢差异，这与王淑凤等[16]研究显示良恶性疾病(肝硬化和肝细胞癌)患者有代谢差异的结论相似。这可能是由于细胞癌变过程中，癌组织可能会引起机体代谢异常，尤其是会促使机体产生大量的能量和物质，以维持癌组织的异常快速生长；同时相关研究认为能量和物质的大量异常产生也是细胞癌变的根本原因[17-18]。

本研究进一步分析良恶性腹水患者代谢产物及通路的差异，OPLS-DA显示恶性组和良性组有34个差异性代谢产物；经KEGG库和HMDB映射显示，与之相关且在良恶性腹水中差异有统计学意义的代谢通路有4条，分别为谷氨酸和谷氨酰胺(L-谷氨酸、L-谷氨酰胺)、半乳糖(D-果糖、D-半乳糖、甘露糖、葡萄糖、D-半乳糖酸)、磷酸戊糖(葡萄糖酸内酯、葡萄糖、核糖、氨基葡萄糖)及谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸(L-天冬氨酸、L-谷氨酸、N-乙酰-L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺)通路，表明与良性腹水比较，恶性腹水主要存在糖代谢、氨基酸代谢差异，其相关代谢通路可能与恶性腹水病程进展密切相关。

谷氨酸和谷氨酰胺代谢通路：谷氨酸和谷氨酰胺参与人体内多种代谢，其在癌组织中的主要作用是促进上皮-间质转化来提高癌细胞的运动性[19-20]。故本研究推测恶性腹水中谷氨酸和谷氨酰胺代谢异常，可能是为了维持癌组织的活动，如促使癌细胞侵袭、脱落、转移等。

磷酸戊糖代谢通路：磷酸戊糖来源于葡萄糖的氧化分解，也是核酸的主要成分之一，癌细胞快速增殖需要大量复制DNA[2-3]。故本研究推测恶性腹水中磷酸戊糖代谢异常，可能是为了用于癌细胞合成大量DNA。

半乳糖代谢通路：半乳糖可转化为葡萄糖分解供能，一般在肠道中由13-乳糖酶分解乳糖产生，而代谢中的半乳糖则主要从尿苷二磷酸葡萄糖生成，同时癌组织的能量主要由葡萄糖直接酵解提供，无需再将半乳糖转化为葡萄糖[12-13]。故本研究推测恶性腹水中半乳糖代谢异常，可能是为了获得癌细胞快速增殖所需的物质。

谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸代谢通路：相关研究显示，癌组织中的谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸与糖代谢、氨基酸代谢有关，谷氨酸经天门冬氨酸氨基转移酶催化可生成天冬氨酸，天冬氨酸可为嘌呤和嘧啶的合成提供底物，使癌细胞快速大量复制其增殖所需DNA；同时丙氨酸进入血液后被运往肝脏，在肝脏中丙氨酸通过联合脱氨基作用释放氨基生成丙酮酸，丙酮酸经糖异生途径生成葡萄糖，为癌细胞快速增殖提供能量[14-15]；故本研究推测恶性腹水中谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸代谢异常，可能是为了给癌细胞增殖提供物质及能量供应。

综上所述，与良性腹水比较，恶性腹水主要存在糖代谢、氨基酸代谢改变，能量通路中的有关Warburg效应的代谢途径变化明显，这些代谢通路改变可能与恶性腹水病程进展密切相关，为失调的癌细胞提供生长和生存所需的各种条件，通过GC-MS等代谢组学检测方法检测相关代谢物及代谢通路有望成为恶性腹水新的诊治方向。