脑缺血后谷氨酸通路及其调控的研究进展

胡捷先(综述) 陈献华(审校)

(复旦大学脑科学研究院医学神经生物学国家重点实验室 上海 200032)



脑缺血后谷氨酸通路及其调控的研究进展

胡捷先(综述) 陈献华△(审校)

(复旦大学脑科学研究院医学神经生物学国家重点实验室 上海 200032)

谷氨酸作为主要的兴奋性神经递质,在脑内正常生理状态下有重要作用,但在脑缺血等多种病理状态下,谷氨酸在脑内大量释放和堆积,导致对神经元的过度刺激,引起兴奋性毒性,并成为缺血性神经元损伤的主要诱发因素。谷氨酸的兴奋性毒性主要通过与神经元细胞膜上的受体结合,引起细胞内Na+和Ca2+增加。胞内Ca2+浓度增加会引起线粒体功能异常、蛋白酶激活、活性氧增加及NO的释放,从而引起神经元的死亡;胞内Na+增加将引起过量水分进入细胞,造成神经细胞毒性水肿和细胞死亡。因此,深入了解脑缺血后上述谷氨酸通路的调控机制,并针对该通路的不同环节进行干预,将为阻止或减轻缺血性神经元损伤提供有效途径。多种针对谷氨酸通路的脑缺血治疗策略正在积极探索中,如抑制谷氨酸合成或释放、增加谷氨酸清除、阻断谷氨酸受体或抑制细胞内Ca2+浓度增加等。本文将对缺血性脑中风后,谷氨酸引起兴奋性毒性的机制以及该系统的调控机制、相应干预策略的研究进展进行综述。

脑缺血; 谷氨酸; 受体; 转运体; 兴奋性毒性; 神经保护

谷氨酸作为主要的兴奋性神经递质广泛分布于脑内,其在哺乳动物脑内的浓度是多巴胺及5-羟色胺等神经递质的1000多倍。谷氨酸参与调控多项细胞活动和生理功能,如细胞的存活和凋亡、学习、记忆、认知、情绪及运动等[1]。尽管谷氨酸参与了中枢系统的一系列重要的生理功能,但从谷氨酸被报道是一种神经毒素以来,结合后来所提出的谷氨酸-钙超载学说[2],已证实其与多种疾病相关,如癫、神经退行性疾病、脑血管卒中等,其与缺血性神经损伤的关系尤为密切。近年来,谷氨酸释放、转运体功能改变、受体表达及其引起的神经细胞损伤级联反应等已成为脑缺血机制的研究重点[3]。本文主要介绍脑缺血卒中后谷氨酸造成损伤的机制,并针对其中相应的靶点寻找可能的临床治疗方法。

谷氨酸的合成、释放和代谢 体内生成谷氨酸的途径有以下3条:(1)谷氨酸-谷氨酰胺循环;(2)神经元和神经胶质细胞利用葡萄糖合成谷氨酸;(3)神经元利用神经胶质细胞所分泌的乳酸盐合成谷氨酸。其中谷氨酸-谷氨酰胺循环是主要方式,但其他方式也是必不可少的[4]。

正常情况下,谷氨酸释放进入突触间隙与受体结合发挥作用,最后将被谷氨酸转运体重摄取重新进入细胞。神经胶质细胞重摄取的谷氨酸经谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)转化为谷氨酰胺或经转氨酶转化为α-酮戊二酸,谷氨酰胺由神经末梢膜上的囊泡谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporters,VGLUTs)摄入神经元,在线粒体内经谷氨酞胺酶(phosphate activated glutaminase,PAG)催化脱氨转变成谷氨酸,在VGLUTs和Ⅴ型ATP酶(Ⅴ-ATPase)的共同作用下进入囊泡,形成谷氨酸-谷氨酰胺循环。α-酮戊二酸则由神经末梢膜上的酮戊二酸转运体摄入神经元,经α-酮戊二酸转氨酶作用生成谷氨酸[5](图1)。

正常生理情况下,谷氨酸能神经末梢突触囊泡是胞外谷氨酸的主要来源,谷氨酸释放分为Ca2+依赖性和非Ca2+依赖性。前者是指电压依赖性Ca2+通道开放,胞外Ca2+进入胞内使囊泡去极化,促使囊泡与突触前膜融合递质释放,主要负责中枢神经系统谷氨酸的释放;后者是指谷氨酸转运体的翻转作用,当细胞内外的离子电势差改变时,转运体将释放谷氨酸至突触间隙中。释放到突触间隙中的谷氨酸能够快速被5种不同的Na+依赖性谷氨酸转运体清除,从而维持谷氨酸稳态[6]。

图1 谷氨酸-谷氨酰胺循环示意图

Fig 1 Schematic representation of glutamate-glutamine cycle

谷氨酸转运体与脑缺血

谷氨酸转运体的分类及转运机制 正常生理状态下,谷氨酸在脑内不同部位的浓度是不一样的,谷氨酸能神经元细胞质、突触囊泡内以及细胞外液中的谷氨酸浓度分别为10 mmol/L、100 mmol/L和1 μmol/L,即谷氨酸主要存在于神经细胞内,囊泡中最多,并且与突触间隙有显著浓度差,这种浓度梯度依赖正常的谷氨酸转运体来维持[7]。当突触间隙的谷氨酸浓度出现异常时,谷氨酸转运体就会迅速做出反应来维持突触间谷氨酸的正常稳态。由此可见,谷氨酸转运体对维持中枢神经系统正常生理功能是非常重要的。

谷氨酸转运体主要包括存在于细胞膜上的兴奋性氨基酸转运体(excitatory amino acid transporters,EAATs)、囊泡谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporters,VGLUTs)以及谷氨酸-半胱氨酸转运体(glutamate-cysteine transporters),本文主要介绍EAATs[8]。目前已知的位于细胞膜的转运体有5种:EAAT1(GLAST)、EAAT2(GLT-1)、EAAT3、EAAT4和EAAT5。EAATs的主要功能是调节细胞外谷氨酸浓度,使之保持在较低的生理水平以避免毒性作用[9]。其中GLT-1(EAAT2)亚型负责95%的谷氨酸重摄取,Harvey等[10]利用带有GLT-1基因的病毒载体感染大鼠后,通过微量渗析缺血引发的胞外谷氨酸堆积明显降低,相反利用反义核苷酸封闭GLT-1后观察到更严重的谷氨酸积聚。

正常情况下,谷氨酸转运体的活性依赖于膜Na+/K+-ATP酶产生的Na+电化学梯度,它们以跨膜Na+、K+和H+浓度梯度为驱动力,EAATs每摄取1个谷氨酸同时摄入2个Na+和1个H+,并排出1个K+和1个OH-或(HCO3-)。细胞内外Na+、K+的正常浓度由Na+-K+泵维持,因此EAATs转运谷氨酸是一种离子依赖性的耗能过程,整个转运过程是可逆的,转运方向是否逆转或何时逆转,取决于细胞膜内外的离子浓度,当跨膜浓度差逆转时,EAATs可变摄取为释放谷氨酸[11](图2)。

The activity of glutamate transporters rely on sodium electrochemical gradient that is maintained through the activity of Na+/K+ATPases.

图2 谷氨酸的跨膜转运示意图

Fig 2 The extracellular glutamate uptake

脑缺血对谷氨酸转运体功能的影响 Johnston等[12]采用核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRS)证明谷氨酸循环-谷氨酰胺与脑内葡萄糖代谢速率密切相关,并且有研究表明谷氨酸的重摄取也是依赖ATP的。当缺血缺氧发生时,大脑供血不足,能量代谢出现严重障碍,谷氨酸的代谢和重摄取都将受到影响。缺血缺氧发生时,一方面,细胞内ATP产生减少,Na+/K+ATP酶功能障碍,K+在胞外堆积,使细胞去极化,Na+浓度梯度被破坏,转运体无法摄取胞外谷氨酸,细胞内高浓度谷氨酸便成为储存库,在胞内高浓度谷氨酸的驱动下,谷氨酸转运体发生逆转,造成细胞外谷氨酸堆积,过度激活谷氨酸受体,触发引起神经元死亡的级联反应[13];另一方面,缺血后通过黄嘌呤氧化酶途径等方式产生大量的氧自由基,这些氧自由基不但可以通过抑制Na+/K+ATP酶活性来影响谷氨酸转运,还将氧化谷氨酸转运体蛋白的半胱氨酸残基,特别是Cys186 和Cys375,以此来抑制谷氨酸转运。这些位点都是谷氨酸转运体高度保守区域,故能够抑制各个亚型的谷氨酸转运体[14]。

对于缺血缺氧发生后谷氨酸转运体表达的变化,不同亚型、不同脑区、不同缺血时间点的变化趋势和水平都不一致,如Ketheeswaranathan等[15]发现在大脑皮质中,缺血缺氧6 h后GLAST表达开始上升,第2天达高峰,第3天恢复正常,GLT-1的表达迟于GLAST,但维持时间较长。而Yehth等[16]发现在海马CA1区,缺血缺氧发生后,无论是蛋白还是mRNA水平,GLT-1表达均迅速减少,甚至丧失。

谷氨酸受体与脑缺血

谷氨酸受体分类 谷氨酸受体包括离子型受体(ionic glutamate receptor,iGluR)和代谢型受体(metabolic glutamate receptor,mGluR)。离子型受体可分为3种亚型:N-甲基-D-天门冬氨酸受体(n-methyl-d-aspartate receptor,NMDA)和非NMDA受体,后者又分为海人藻酸受体(kainic acid receptor,KAR)和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionicacid receptor,AMPAR)。

NMDA受体广泛分布于海马和皮层中,由NR1和NR2两种亚单位构成。该受体兴奋时主要引起Na+、Ca2+内流和K+外流。NMDA受体参与机体多项生理及病理活动,如学习与记忆、神经元重塑、缺血缺氧毒性作用、癫及神经退行性病变等[17]。AMPA和KA受体则对电位不敏感,谷氨酸为其内源性激动剂,即无需去极化,与谷氨酸结合即可激活受体。其中AMPA受体的分布与NMDA平行,有4种亚基,主要介导中枢神经系统的快速兴奋性突触传递,与学习及记忆等功能有关[18];KA受体则主要分布在海马CA3、皮质等区域,由5个亚基构成,主要与Ca2+代谢、突触强化和氧化应激等有关[19]。

mGluR属于G蛋白偶联受体超家族,已经克隆出mGluR的8种亚型:mGluR1～mGluR8。根据mGluR氨基酸序列的同源性、胞内信号转导机制及药理学特性分为3型,即Ⅰ型:mGluR1和mGluR5,Ⅱ型:mGluR2和mGluR3,Ⅲ型:mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8[20]。

谷氨酸的突触释放和突触后效应 谷氨酸神经递质以囊泡的形式储存于神经末梢,当突触前膜去极化时,突触前膜的电压门控性Ca2+通道(voltage-gated calcium channel,VGCC)开放,囊泡的去极化促进囊泡与突触前膜融合释放谷氨酸,谷氨酸与突触后膜上的NMDAR和AMPAR结合后发挥神经递质作用。发挥作用后,谷氨酸被转运体快速重摄取进入胞质,可以在突触囊泡中暂时保存,直至下一次释放[21](图3)。

Sequestered in vesicles of the pre-synaptic neuron,glutamate is released into thesynaptic cleft upon depolarization.Once released,glutamate binds to ionotropic or metabotropic receptorsof the post-synaptic neuron to potentiate signal transduction.Glutamate clearance from the synaptic cleft is primarily handled by astrocyte-specific excitatory amino acid transporters.The three actions join forces to keep the homeostasis of glutamate.

图3 谷氨酸突触释放、受体激活及重摄取示意图

Fig 3 The synaptic release,stimulation of glutamate receptor and uptake of glutamate in synapse

脑缺血后过度激活谷氨酸受体触发引起神经元死亡的级联反应 在正常生理条件下,由于重摄取机制的存在,神经元只可能短暂暴露于低浓度谷氨酸。但是当病理情况出现时,由于正常机制被破坏,神经元会暴露于高浓度谷氨酸,细胞功能出现障碍,造成细胞损伤。

Choi等[22]发现在体外细胞培养中,当谷氨酸浓度达到10 μmol/L时即可导致神经元的死亡,Benveniste等[23]发现当浓度达到100 μmol/L时可以持续过度地激活谷氨酸受体。缺血条件下,大脑血流下降,ATP供给减少,一方面直接抑制谷氨酸转运体的功能,谷氨酸在突触间隙中积聚,过度激活谷氨酸受体;另一方面,由于过度激活谷氨酸受体,使得细胞内外的Na+、Ca2+等的浓度稳态无法维持,导致谷氨酸转运体功能翻转,胞内高浓度谷氨酸成为突触间隙中谷氨酸的来源之一,以上各种因素循环相互影响,不断加重谷氨酸超载。细胞间隙堆积的谷氨酸使谷氨酸受体过度激活,引起神经细胞内Ca2+超载、NO生成增多[24]等级联式毒性反应,即兴奋性毒性,最终导致神经细胞死亡(图4)。

脑缺血后谷氨酸兴奋性毒性引起胞内Ca2+超载对细胞的影响 Ca2+作为谷氨酸兴奋性毒性级联反应中的重要一环,在缺血缺氧条件下,对细胞的损伤作用不容小觑。Ca2+是钙元素在人体中的主要存在形式,也是机体各项生理活动不可缺少的离子,它在维持细胞膜两侧的生物电位,维持正常的神经传导功能,参与神经递质合成与释放、激素合成与分泌中都有无可替代的作用。脑缺血后,大量堆积的谷氨酸可通过以下机制引起细胞内的Ca2+浓度大幅上升:(1) 过度激活NMDAR引起钙离子内流;(2) 激活mGluR受体,控制内质网的Ca2+释放,提高胞内Ca2+浓度[25]。Ca2+浓度的急剧升高会使中性蛋白酶、核酸内切酶和磷脂酶等被激活,造成细胞膜、DNA的破坏,使神经元骨架破坏,同时产生大量自由基,形成凋亡小体,最终引起神经元凋亡。

脑缺血后谷氨酸兴奋性毒性引起线粒体功能障碍对细胞的影响 线粒体作为细胞的能量站,是细胞内氧化磷酸化和合成ATP的主要场所,是细胞的生命线。除了为细胞供能外,线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程,并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。研究发现当胞内Ca2+浓度超过0.5 μmol/L时,线粒体将重摄取胞内Ca2+[26];缺血再灌注24 h后,线粒体中Ca2+浓度从1～3 nmol/mg 上升到 6～9 nmol/mg[27]。线粒体中大量Ca2+涌入使其膜电位发生变化,进而引发线粒体多条途径的功能障碍,包括抑制线粒体的呼吸作用、引起细胞色素c以及NADH的释放及其后续的效应,进而导致线粒体和细胞的多种损伤,造成神经元死亡(图5)。

在上述由谷氨酸兴奋毒引起的线粒体功能障碍级联反应中,caspase-3在引起DNA损伤和神经元凋亡中起到重要作用。研究发现,capase-3功能被抑制后,由谷氨酸处理所导致的细胞死亡率大大降低(降低幅度达50%)[28]。此外,caspase-3还直接影响缺血缺氧损伤的严重程度(如坏死、水肿面积)。

谷氨酸兴奋性毒级联反应中,钙激活的中性蛋白酶(calpains)也发挥重要作用。研究表明,当线粒体中Ca2+浓度升高能够激活失活的蛋白酶(包括calpains),而calpains在坏死和凋亡中发挥着重要作用,能够抑制Na+-Ca2+交换泵和mGluR-I。除此之外,caspase-3还将抑制抗凋亡因子蛋白分子(如Bcl-2、Bcl-XL和Bid)活性,并促进促凋亡因子Bax表达,激活下游的caspase-3,进一步清除钙蛋白酶抑制蛋白,两者相互作用,共同诱导神经细胞死亡[29]。

脑缺血后谷氨酸兴奋性毒性引起活性氧自由基产生对细胞的影响 在缺血缺氧中,活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)与谷氨酸兴奋性毒性有密不可分的关系。ROS能够通过氧化和损伤脂质、DNA、蛋白质来损伤细胞[30](图6)。

脑缺血后谷氨酸兴奋性毒性产生的NO对细胞的影响 脑缺血后,产生的大量谷氨酸会过度激活NMDA受体,导致一氧化氮合酶(nitric oxide synthetase,NOS)活化和高浓度NO产生,从而对细胞造成损伤;而NOS抑制剂可降低NMDA的神经毒性[31]。NO主要通过减少细胞能量供给、增强DNA损伤、将超氧化合物转化成过氧亚硝酸盐等来破坏细胞。尽管Gepdiremen等[32]的研究表明低浓度NO具有神经保护作用,但另一方面,NO作为一个高活性分子,可通过增加毒性自由基的水平来损伤细胞。

针对谷氨酸损伤机制的治疗方式

缺血缺氧预处理 Blanco等[33]已证明短暂的轻微脑缺血能够增加脑对缺血的耐受,这就是脑缺血预处理。脑缺血预处理在提高脑缺血耐受性中,通过上调非Ca2+依赖释放谷氨酸以及提高谷氨酸转运体表达等方式增强细胞对缺血的抵抗(图7)。

干预谷氨酸通路的药物在脑缺血损伤中的作用尽管大量文献报道了脑缺血损伤中谷氨酸兴奋性毒性的机制,但仍没有找到在临床上适用于脑缺血损伤的治疗方法。谷氨酸在缺血中产生兴奋性毒性这一过程涉及诸多方面,若只抑制其中某一环节,谷氨酸还可以绕过这一环节通过其他路径达到最终效果。针对单靶点的神经保护药物往往可以在动物实验中减少梗死体积、改善神经功能,但在临床研究中却得不到有效结果[34]。这些现象提示我们可以考虑采用联合治疗的方式,从多方面下手共同抵抗脑缺血损伤。

由于谷氨酸受体阻断剂的治疗效果低于预期,可以考虑从谷氨酸作用的更早阶段入手,比如谷氨酸的合成和释放;或对谷氨酸受体下游的信号通路进行干预,如使用抗氧化剂阻断氧化等。具体干预位点见图8。已有研究发现,β-内酰胺拮抗剂(如头孢曲松钠)能够通过刺激GLT-1的表达增加,从而增加谷氨酸的重摄取,降低脑缺血损伤,而不影响其他转运体[13]。

谷氨酸用于治疗性研究的现状和未来策略 关于谷氨酸在脑缺血中的毒性作用及其机制已有大量研究,但仍不能满足临床需要。目前关于脑缺血的治疗方式仍局限于抗凝剂、溶栓剂等,亟待开发新的有效安全的药物。近期发现结合力改进后的新型谷氨酸受体拮抗剂具有满意的神经保护作用,由此带来了新的发展方向。

结语 在脑缺血过程中谷氨酸不是简单的神经递质,其在神经元死亡环节中也发挥一定的作用,其所引发的兴奋性毒性是导致神经细胞死亡的重要原因之一。虽然在临床脑缺血治疗上针对谷氨酸的干预已有各种尝试,但尚未获得安全有效的治疗方式,仍需进一步的探索。

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Research progress of glutamatergic pathway after cerebral ischemia and its regulatory mechanism

HU Jie-Xian, CHEN Xian-Hua△

(StateKeyLaboratoryofMedicalNeurobiology,InstituteofBrainResearch,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Although acting as an important excitatory neurotransmitter and play roles in physiological state of mammalian brain,glutamate also play key roles under several pathological conditions,including cerebral ischemia.The extracellular glutamate was accumulated under cerebral ischemia,which leads to overexcitation of neurons,causing the exitotoxicity and injury of neurons.The eccessive glutamate stimulates the glutamate NMDA receptors on neuronal membrane,leading to influx of Na+and Ca2+.The overload of intracellular Ca2+will lead to a variety of cell abnormalities including mitochondrial dysfunction,activation of proteases and nitric oxide synthase,accumulation of reactive oxygen species and furthermore,cell death.In addition,the elevated intracellular Na+will also induce cytotoxic edema and cell death.Therefore,comprehensive understanding of the regulatory mechanism of glutamatergic pathway may provide novel therapeutic target for reducing neuronal injury under cerebral ischemia.Recently,a variety of neuroprotective strategies have been explored which focus on blocking of glutamate-mediated excitotoxity,e.g.inhibiting of synthesis and release of glutamate,increasing of glutamate clearance,blocking of glutamate receptors,inhibiting of the elevation of intracellular Ca2+and so on.This review aims to make a general summary on the progress in regulatory mechanism of glutamatergic pathway and the intervention strategies after cerebral ischemia.

cerebral ischemia; glutamate; receptor; transporter; excitotoxicity;neuroprotection

国家自然科学基金 (31571037)

Q51

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2016.06.0015

2016-01-18;编辑:段佳)

△Corresponding author E-mail:xhchen@fudan.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31571037).