一株红树植物内生真菌Pseudallescheria boydii L32的代谢产物*

陈若兰，黎子洋，巫惠珍，罗艺盟，佘志刚，熊亚红，李春远

1. 生物基材料与能源教育部重点实验室/华南农业大学材料与能源学院，广东 广州 510642

2. 中山大学化学学院，广东 广州 510275

红树林真菌因特殊的沿海生存环境，能产生结构多样的具有各种活性的新代谢产物，是农药和医药开发的重要资源之一［1-3］。半红树植物苦槛蓝Myoporum bontioides在我国沿海分布广泛，其不同组织部位蕴含着丰富的内生真菌资源［4］，在对其部分内生菌株代谢产物的研究中，我们获得了10 多个具有强抗菌活性的新代谢物，包括细胞松弛素生物碱、环六脂肽、色原酮、异香豆素及六、七元单环内酯等结构类型［5-7］。本文研究纯化自该植物叶片的另1 株真菌Pseudallescheria boydiiL32 的代谢产物，共分离鉴定了10 个单体代谢物（图1），包括2，2′-oxybis（1，4）-di-tert-butylbenzene（1），livistone B（2），simplicildone A（3），simplicildone B（4），botryorhodine B（5），（-）-regiolone（6），citreoanthrasteroid B（7），豆甾-4-烯-3-酮（8），丁二酸（9）和草酸（10）。其中代谢物1，3，4，5，7，8为首次从Pseudallescheria属分离得到。活性测试显示，代谢物1，4，5，6 对O6 血清型大肠杆菌（人致病性），代谢物1，5 对O78 血清型大肠杆菌（禽致病性）显示出抑菌活性。

图1 代谢物1～10的结构Fig.1 The structures of compounds 1-10

1 实验部分

1.1 仪器、试剂及材料

Bruker Biospin AV 600 核磁共振波谱仪，MDS SCIEX APCI 2000 液质联用仪，Horiba SEPA-300旋光仪。GF254 薄层及200-300 目柱层析硅胶（青岛海洋化工公司），Sephadex LH-20 凝胶（GE Healthcare），其他试剂为分析纯。Pseudallescheria boydiiL32 分离自苦槛蓝叶片，通过PCR 扩增真菌核糖体ITS 基因区段，并登陆NCBI数据库Blast搜索与MK646016.1 菌株对比（相似度99.82%）得到鉴定，大肠杆菌（O6，O78 血清型）引自华南农业大学天然资源再生与利用研究室，保藏于华南农业大学材料与能源学院。

1.2 菌种发酵培养及分离

采用与文献相同的大米培养基［8］、培养体积及培养时间，将发酵物用乙醇萃取3次，减压浓缩得提取物31.2 g，通过常规微生物代谢产物分离流程［8］，分别得到代谢物1（5.1 mg），2（3.5 mg），3（2.2 mg），4（2.3 mg），5（6.1 mg），6（1.8 mg），7（3.2 mg），8（2.6 mg），9（60.4 mg），10（35.1 mg）。

1.3 抗菌活性测试

用二倍稀释法［9］测试代谢物1～8 体外对O6，O78 血 清 型 大 肠 杆 菌（Escherichia coliO78 和Escherichia coliO6，购自上海烜雅生物科技有限公司）抗菌活性，以最小抑菌浓度（MIC）表示抗菌效果，用头孢拉定作阳性对照，平行测定3次。

1.4 代谢物波谱数据

代谢物1：C28H42O，黄色油状物，ESI -MSm/z394.36［M+H］+，1H NMR（400 MHz，acetoned6）δ7.57（d，J= 8.6 Hz，2H），7.47（d，J= 2.5 Hz，2H），7.26（d，J= 8.6，2.5 Hz，2H），1.37（s，18H），1.30（s，18H）。13C NMR（100 MHz，acetone-d6）δ148.6，148.2，139.3，125.4，124.9，119.9，35.5，35.1，31.7，30.6。

代谢物2：C17H16O6，白色粉末，ESIMSm/z317.14［M+H］+，1H NMR（400 MHz，acetone-d6）δ6.65（s，1H），6.53（s，1H），5.06（s，2H），2.39（s，3H），2.38（s，3H），2.14（s，3H）。13C NMR（100 MHz，acetone-d6）δ166.0，163.9，161.4，153.4，144.8，144.5，143.8，128.2，116.4，116.3，115.4，114.9，113.7，56.1，21.2，16.8，9.3。

代谢物3：C18H18O6，无色固体，ESIMSm/z353.1［M+Na］+，1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ8.40（s，1H），6.62（s，1H），6.43（s，1H），5.04（s，2H），4.87（s，1H），3.52（s，3H），2.46（s，3H），2.33（s，3H），2.23（s，3H）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ163.8，161.0，160.3，151.2，145.5，143.8，143.7，127.0，116.7，114.6，113.5，113.5，110.7，68.2，58.9，21.4，17.2，9.3。

代谢物4：C19H20O6，无色固体，ESIMSm/z345.1［M+H］+，1H NMR（400 MHz，acetone-d6）δ6.67（s，1H），6.53（s，1H），4.85（s，2H），3.64（q，J= 7.0 Hz，2H），2.38（s，3H），2.38（s，3H），2.14（s，3H），1.19（t，J= 7.0 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，acetone-d6）δ163.3，160.7，160.3，153.4，146.9，145.4，144.5，128.3，116.3，115.6，114.8，114.1，113.6，66.7，62.9，21.3，16.5，15.5，9.3。

代谢物5：C17H14O6，无色固体，ESIMSm/z313.1［M-H］-，1H NMR（400 MHz，acetone-d6）δ10.72（s，1H），6.76（s，1H），6.58（s，1H），2.50（s，3H），2.34（s，3H），2.17（s，3H）。13C NMR（100 MHz，acetone-d6）δ194.6，166.3，165.9，162.5，154.7，154.1，144.1，143.3，128.1，117.8，115.7，114.1，113.9，111.7，22.2，17.0，9.4。

代谢物6：C10H10O3，无色晶体，ESIMSm/z179.1［M+H］+，= -4.2（c0.10，MeOH），1H NMR（400 MHz，acetone-d6）δ12.46（s，1H），7.53（dd，J= 8.4，7.2 Hz，1H），7.12（d，J= 7.2 Hz，1H），6.83（d，J= 8.4 Hz，1H），4.89（dd，J= 8.5，3.8 Hz，1H），4.71（s，1H），2.74（m，1H），2.67（m，1H），2.33（m，1H），2.13（m，1H）。13C NMR（100 MHz，acetone-d6）δ204.6，162.4， 147.1， 136.6， 117.4， 116.2， 115.3，66.8，35.0，32.7。

代谢物7：C28H40O，无色油状物，ESIMSm/z393.3［M+H］+，= +23.5（c0.10，CHCl3），1H NMR（400 MHz，acetone-d6）δ6.64（s，1H），6.63（d，J= 9.6 Hz，1H），6.47（d，J= 10.0 Hz，1H），5.31（dd，J= 6.4，4.8 Hz，1H），5.27（dd，J=7.1 Hz，1H），4.04（m，1H），2.97（dd，J= 16.5，5.2 Hz，1H），2.81（m，2H），2.80（m，1H），2.45（dd，J= 16.3，7.6 Hz，1H），2.17（s，3H），2.02～ 1.86（m，5H），1.75 ～ 1.46（m，5H），1.30（d，J=11.8 Hz，3H），1.16（d，J=6.6 Hz，3H），0.96（d，J= 6.8，3.0 Hz，3H），0.86（d，J= 6.5 Hz，3H），0.58（s，3H）。13C NMR（100 MHz，acetoned6）δ140.1，137.3，136.3，135.6，133.1，132.3，132.0，131.2，124.6，123.8，67.7，52.6，51.1，44.3，43.7，41.8，37.2，33.8，32.2，30.3，28.7，22.6，21.2，20.3，20.0，18.1，14.4，11.7。

代谢物8：C29H48O，无色油状物，ESIMSm/z413.4［M+H］+，= +39.2（c0.10，CHCl3），1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ5.72（s，1H），1.18（s，3H），0.92（d，6.6 Hz，3H），0.86（d，7.2 Hz，6H），0.82（d，7.2 Hz，3H），0.71（s，3H），2.45～1.03（m，29H，不含1.18 的甲基及1.6 附近水峰信号）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ199.5，171.6，123.0，56.2，55.6，53.6，45.5，42.6，39.1，38.4，36.7，35.6，35.2，34.5，33.7，33.5，32.6，29.7，28.3，26.2，24.3，23.6，21.0，19.7，19.1，18.9，17.5，12.1，12.0。

代谢物9：C4H6O4，无色晶体，ESIMSm/z119.1［M+H］+，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ12.15（br s，2H），2.40（s，4H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ173.4，28.9。

代谢物10：C2H2O4，无色晶体，ESIMSm/z91.0［M+H］+，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ13.75（br s，2H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ161.1。

2 结果与讨论

ESIMS 谱m/z394.36［M+H］+，1H NMR 谱δ7.57（d，J= 8.6 Hz，2H），7.47（d，J= 2.5 Hz，2H），7.26（d，J=8.6，2.5 Hz，2H）3 组氢化学位移及偶合常数表明代谢物1 有2 个对称的1，2，4-三取代苯环，δ1.37（s，18H），1.30（s，18H）的峰形及积分表明存在4 个叔丁基，13C NMR 谱观察到δ148.6，148.2，139.3，125.4，124.9，119.9 共6 组芳香碳信号，结合分子式C28H42O 进一步证明有2个对称的苯环存在且二者通过氧原子连接。与文献［10］对照，数据基本一致，鉴定代谢物为2，2′-oxybis（1，4）-di-tert-butylbenzene。

代谢物2 的1H NMR 谱δ6.65，6.53 的单峰及13C NMR 谱δ113.7～163.9 的12 个芳香碳，推测存在2 个五取代苯，166.0 是酯羰基碳。1H NMR谱2.39（s，3H），2.38（s，3H），2.14（s，3H）是3个取代在苯环上的甲基，5.06（s，2H）是与氧或羟基相连的亚甲基。结合ESIMS 数据剩余的相对分子质量，将剩余的结构单元归属为羟基和氧。与文献［11］对照，数据基本一致，鉴定为livistone B。

代谢物3 的1H NMR 谱比代谢物2 多出1 个甲氧基信号δ3.52（s，3H）。对比剩余数据表明它们其他的结构单元一致，因此代谢物3 是2 中的1 个羟基变为了甲氧基的衍生物，与文献［12］对照，数据基本一致，鉴定为simplicildone A。

代谢物4 的1H NMR 谱比代谢物2 多出δ3.64（q，J= 7.0 Hz，2H），1.19（t，J= 7.0 Hz，3H）的乙氧基信号，ESIMS 谱也显示前者比后者多出28的相对分子质量，根据化学位移值可初步判断该乙氧基连接在脂肪碳上，与文献［12］对照，数据基本一致，鉴定为simplicildone B。

代谢物5 的1H NMR 谱δ10.72（s，1H）及13C NMR 谱δ194.6 比代谢物2 多出1 个醛基，同时后者连羟基的亚甲基（δH4.85，δc56.1）在前者1H NMR 谱中未被观察到，据此推测代谢物5 是代谢物2羟甲基转化为醛基的衍生物，与文献［13］对照，数据基本一致，鉴定为botryorhodine B。

代谢物6 的1H NMR 谱δ7.53（dd，J= 8.4，7.2 Hz，1H），7.12（d，J=7.2 Hz，1H），6.83（d，J=8.4 Hz，1H）是苯环上互为邻位的3 组氢。滴加重水后根据1H NMR 谱信号消失情况，发现有2 个羟基，δ12.46（s，1H）是与羰基形成分子内氢键的羟基，4.71（s，1H）是另1 个羟基。13C NMR 谱δ162.4，147.1，136.6，117.4，116.2，115.3 再次确认了苯环的存在，此外还显示有1 个羰基（δ204.6），1 个连羟基的亚甲基（δ66.8）及另2 个亚甲基（δ35.0 和32.7）信号。该代谢物核磁及比旋光度与文献［14］报道基本一致，鉴定为（-）-regiolone。

代谢物7的1H NMR 谱δ6.64～5.27 有5个双键氢 的 信 号，13C NMRδ140.1～123.8 有10 个 双 键碳，推测可能含有苯环。1H NMR 谱δ4.04（m，1H）是连羟基的次甲基信号，δ2.17（s，3H）及δ1.30～0.58 之间积分分别为3 的5 组氢是6 个甲基信号，据此与文献［15］报道代谢物的核磁及比旋光度数值对比基本一致，鉴定为citreoanthrasteroid B。

代 谢 物8 的1H NMR 谱 在δ0.71～2.45 高 场 区的化学位移（通常为脂肪甲基、亚甲基、次甲基信号）和积分情况以及对应的13C NMR 谱δ12.0～56.2 的碳均与典型的甾醇特征吻合［16］，其中δH1.18（s，3H），0.92（d，6.6 Hz，3H），0.86（d，7.2 Hz，6H），0.82（d，7.2 Hz，3H），0.71（s，3H）是6 个甲基信号。此外，δH5.72（s，1H）是双键H信号；13C NMR 谱δ199.5，171.6，123.0 说明存在1 个羰基且与上述双键共轭，据此与文献［17］对照，数据基本一致，鉴定为豆甾-4-烯-3-酮。

代谢物9 的1H NMR 谱δ12.15（br s，2H）和2.40（s，4H）是羧基H 和连接羧基的亚甲基信号，分别对应于13C NMR 谱δ173.4 的羧基碳和28.9 的亚甲基信号，结合ESIMSm/z119.1［M+H］+的分子离子峰并与文献［18］对照，数据基本一致，鉴定为丁二酸。

代谢物10 的1H NMR 谱δ13.85（br s，2H）是羧基H 信号，对应于13C NMR 谱δ161.1 的羰基碳信号，结合ESIMSm/z91.0［M+H］+的分子离子峰并与文献［19］对照，数据基本一致，鉴定为草酸。

上述代谢物1，3，4，5，7，8首次从Pseudallescheria属分离得到，丰富了该菌属的代谢产物库。文献报道代谢物2 和3 具有磷酸二酯酶5 抑制活性［20］，代谢物5具有抗枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、土曲霉菌Aspergillus terreus、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum活性及抑制人子宫颈癌细胞（Hela）、脐静脉内皮细胞（HUVEC）、慢性骨髓性白血病细胞（K562）增殖活性［13］，代谢物7 具有抗表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis， 蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus活性及乙酰胆碱酯酶抑制活性［21］，但尚未见所分离代谢物抗大肠杆菌活性的研究报道。本文活性测试结果显示，代谢物1，4，5，6对人致病性O6 血清型大肠杆菌MIC 分别为50，12.5，25，100 μg/mL，代谢物1，5 对禽致病性O78 血清型大肠杆菌MIC 均为100 μg/mL，其余所测MIC 值均高于200 μg/mL（阳性对照头孢拉定对O6 和O78血清型大肠杆菌MIC 分别为3.13 和6.25 μg/mL）。代谢物4，5 对O6 型大肠杆菌活性相对较强，且结构中含有的容易修饰的活泼位点较多，如羟基、芳甲基、醛基等，因此可优先考虑作为抗O6 血清型大肠杆菌的先导代谢物开展结构改造研究。禽大肠杆菌是由致病性大肠杆菌所引起的禽病，是危害家禽养殖业的重要传染病之一［22］，其中O78型大肠杆菌引起的禽大肠杆菌病在国内较为常见［23］，但专用的防治兽药极少，后续有必要开展代谢物1，5 防治O78 型禽大肠杆菌病的体内疗效研究。