颅脑损伤患者miR-124水平变化及其对预后的预测价值分析*

王上桥，孙占玉，吴运桥，梁定兴

海南西部中心医院神经外科，海南儋州 571700

目前颅脑损伤(TBI)已成全球公共卫生问题之一，其病情危急、致残及致死率高，其中致残率、致死率位居各类创伤首位，是人类第三大致死病因[1]。临床上主要通过磁共振及扩展格拉斯哥结局量表(GOS-E)[2]评估TBI病情，但前者仅可评价病情无法直观描述病情进展，而GOS-E存在一定主观性，亦无法提供客观评估依据。尽管当前也有较多研究从血清学层面入手评估TBI患者病情转归，但鉴于此疾病转归机制复杂，仍无有效预测机制。因此，积极探索TBI患者损伤程度及预后评估机制仍是临床研究重点、热点之一。微小RNA(miRNA)是广泛分布在机体内的一种非编码微小核糖核酸，其不仅参与机体代谢、细胞增殖分化等多种生物过程，且具有相对稳定性及组织特异性等特征[3]。miR-124是一种神经系统特异性miRNA，约占大脑皮质总miRNA的25%～48%[4]。研究证实，脑损伤大鼠血miR-124水平增加，提示其可能参与损伤后神经修复等生理病理过程[5]。但TBI患者miR-124水平及其对预后的预测价值如何尚无定论，本研究拟为临床完善相关预警机制提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年5月至2021年8月本院收治的108例TBI患者作为研究对象，其中72例作为训练组，36例作为验证组。另选取同期36例健康体检者作为对照组。纳入标准：(1)训练组及验证组有明确头部外伤史，符合TBI诊断标准[6]；(2)训练组及验证组伤后入院时间不足12 h；(3)训练组及验证组伤前营养状况良好；(4)对照组身体健康，无创伤史及脏器病变。排除标准：(1)伤前存在感染者；(2)有既往颅脑损伤史；(3)肿瘤患者；(4)存在严重心、肝、肾等系统疾病者。本研究经医学伦理委员会审批通过(批号：20190424145)。所有研究对象知情研究内容，并签署同意书。

训练组中男42例，女30例；年龄28～57岁，平均(41.89±5.78)岁；体质量指数18～26 kg/m2，平均(22.26±1.33)kg/m2；合并高血压11例，合并糖尿病6例，合并高脂血症12例。验证组中男20例，女16例；年龄25～58岁，平均(40.77±5.91)岁；体质量指数18～26 kg/m2，平均(22.12±1.25)kg/m2；合并高血压7例，合并糖尿病4例，合并高脂血症7例。对照组中男21例，女15例；年龄24～58岁，平均(41.23±6.01)岁；体质量指数18～26 kg/m2，平均(21.92±1.30)kg/m2；合并高血压8例，合并糖尿病5例，合并高脂血症6例。3组研究对象性别、年龄、体质量指数、慢性疾病史比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1TBI治疗方法 参照《颅脑创伤临床救治指南》[7]，TBI患者入院后均予以积极治疗，治疗措施包括监护病情，维持呼吸道畅通，降颅压，治疗脑水肿，防范呼吸、心脑及消化道等并发症。若存在手术指征则积极手术治疗。患者出院后通过进行电话、门诊随访，了解患者康复情况，并通知患者出院后3个月时到院进行预后恢复状态评估。

1.2.2检测方法 于TBI患者入院时、出院前1 d及对照组体检当日，采用非抗凝真空管采集肘静脉血4 mL，在4 ℃下，以转速3 000 r/min、半径8 cm离心15 min，收集血清，液氮保存。采用赛默飞Paris试剂盒提取总RNA，检测RNA纯度、浓度。采用赛默飞反转录试剂盒测定miR-124水平。miR-124正向引物：5′-GCTAAG-GCACGCGGTG-3′，反向引物：5′-GTGCAGGTC-CGAGGT-3′。U6正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μL，0.8 μL上游引物，2 μL cDNA，双蒸水加至20 μL。反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-124水平。

1.2.3观察指标 (1)比较对照组及训练组入院时、出院前1 d miR-124水平。(2)分析入院时miR-124水平与训练组损伤程度的关系。采用格拉斯哥昏迷量表(GCS)评分[8]评估损伤程度，13～15分为轻度，9～12分为中度，3～8分为重度。(3)评估训练组出院后3个月时的GOS-E评分，5～8分为预后良好，1～4分为预后不良，比较不同预后TBI患者资料。(4)采用Cox回归模型分析TBI患者预后影响因素。(5)采用受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-124对TBI患者预后的预测价值。(6)检测验证组miR-124水平进行组外验证。

2 结 果

2.1训练组与对照组及训练组治疗前后miR-124水平比较 训练组入院时miR-124水平为2.58±0.61，出院前1 d为1.43±0.40，对照组为1.06±0.27。训练组入院时、出院前1 d miR-124水平均高于对照组(t=14.244、5.004，P<0.05)，训练组出院前1 d miR-124水平低于入院时(t=13.401，P<0.05)。

2.2训练组入院时miR-124水平与损伤程度的关系 72例患者中轻度20例、中度35例、重度17例，轻、中、重度TBI患者miR-124水平分别为2.21±0.49、2.57±0.58、3.04±0.70。不同损伤程度TBI患者miR-124水平比较，差异均有统计学意义(F=9.173，P<0.05)；随着患者损伤程度加重，miR-124水平呈升高趋势(P<0.05)。训练组入院时miR-124水平与损伤程度呈正相关(r=0.628，P<0.05)。见图1。

图1 训练组入院时miR-124水平与损伤程度的关系

2.3训练组预后影响因素的单因素分析 训练组72例患者随访3个月，失访2例，有效随访70例，其中预后良好52例，预后不良例18例。单因素分析结果显示，损伤程度、中线移位>5 mm、合并脑疝、瞳孔对光反应比例及脑血肿体积、入院时及出院前1 d miR-124水平在预后良好与预后不良患者间差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 训练组预后影响因素的单因素分析或n(%)]

续表1 训练组预后影响因素的单因素分析或n(%)]

表2 变量赋值

2.4训练组预后影响因素的多因素Cox回归模型分析 将结果2.3中P<0.05的因素进行多重共线性检验，发现入院时miR-124水平、损伤程度存在共线性(VIF>5)，故手动移除损伤程度、入院时miR-124。将预后情况作为因变量，中线移位>5 mm、合并脑疝、瞳孔对光反应比例、脑血肿体积、出院前1 d miR-124作为自变量，具体赋值见表2。采用多因素Cox回归模型进行分析，结果显示，校正合并脑疝、中线移位>5mm、瞳孔对光反应、脑血肿体积后，出院前1 d miR-124水平是预后的独立影响因素(P<0.05)。见表3。

表3 训练组预后影响因素的多因素Cox回归模型分析

2.5出院前1 d miR-124对预后的预测价值 将预后不良患者数据作为阳性数据，预后良好患者数据作为阴性数据绘制ROC曲线，结果显示，出院前1 d miR-124预测TBI患者预后不良的AUC为0.784(95%CI：0.669～0.873，P<0.05)，Youden指数最高值为0.487，预测的cut off值为1.41，灵敏度为83.33%，特异度为75.38%。见图2。

图2 出院前1 d miR-124预测TBI患者预后的ROC曲线

2.6组外验证 以出院前1 d miR-124≤1.41为预后不良的判断标准对验证组36例患者进行组外验证，结果显示，出院前1 d miR-124预测TBI患者预后不良的灵敏度为80.00%，特异度为80.77%，准确度为80.56%。见表5。

表5 组外验证的预测结果(n)

3 讨 论

TBI主要包括两个层面，一是原发性机械脑损伤，二是伤后出现的一系列病理生理变化所致神经退行性改变[9]。近年来随着医疗技术的快速发展，TBI病死率得到显著控制，但由于此类患者脑神经组织损伤严重，预后多数存在不同程度残疾，而早期评估其预后积极完善干预治疗方案是改善预后的关键环节。

近年有关TBI预后的研究较多，如：孙国章等[10]提出，首诊GCS评分是此类患者预后的独立相关因素；郭异之等[11]研究表明，白细胞介素-6等炎症因子水平升高是重度TBI患者近期预后的危险因素，可为临床评估预后提供参考。但从TBI病情转归的病理生理相关机制角度分析不难发现，其预后转归涉及炎症反应、神经组织损伤修复等多个过程，而此过程中神经修复相关调控机制如何变化尚无定论。miR-124属神经系统特异性miRNA，其能凭借5′端种子序列与3′端非编码区不完全或完全配对结合实现对蛋白质的合成及功能的调控，继而控制、调节各项生理功能[12-14]。研究证实，miR-124基因缺失鼠存在大脑体积减小、轴突发育缺陷、神经细胞死亡等发育表型变化[15]。据此推测miR-124可能在神经系统发育中负责促进神经元分化及轴突再生修复等重要生理过程，或可为临床评估TBI病情提供新视角。本研究结果显示，TBI患者入院时miR-124水平明显升高，而出院前1 d降至较低水平，反映出miR-124水平降低与病情康复有关。可能原因：TBI发生后主要由神经干细胞迁移并整合进入损伤脑神经组织中，并对TBI引起的神经结构损伤及功能损毁进行修复，而miR-124作为促神经细胞增殖、分化的重要活性物质，TBI发生后出现的一系列生理病理反应能激活miR-124大量表达以满足脑神经损伤修复的需求，且损伤越严重，可能其水平越高以满足神经损伤修复的需求，同时随病情康复，此需求量逐渐减少，故表现为外周血miR-124水平降低[16-18]。由此上述推测得以证实。

此外，本研究还发现，预后良好患者miR-124水平较高，与部分动物实验研究[19-20]的结论相符。经Cox回归模型分析发现，miR-124水平升高是TBI患者预后不良的独立保护因素，此特征和miR-124水平与损伤程度呈正相关的结论相悖，但深入分析主要是因TBI病理机制复杂，可能会损伤促miR-124表达的功能结构模块，致miR-124表达相对不足或实际情况下miR-124表达能力有限，无法满足TBI所致神经结构及功能损害修复所需，因此，当miR-124水平较低时患者预后不良，miR-124仍保持较高水平时可能更利于促进神经损伤修复[21]。这与临床案例中重度TBI患者也可恢复最佳临床状态，而中度TBI患者反而恢复不佳的实例相符。但也有研究显示，miR-124可能在神经损伤中具有双重作用，如在急性脑梗死患者中miR-124水平越高梗死体积越小，但过高水平可促进炎症反应，反而不利于预后恢复[22]，其具体的水平梯度尚未明确。但本研究未发现此特征，分析可能与病例选取不同有关，TBI的损伤程度决定因素更侧重于外界暴力作用情况，而脑梗死体积受自身内部影响较大，miR-124在TBI患者中是否具有类似的水平梯度仍需继续探讨。ROC曲线分析结果显示，出院前1 d miR-124预测TBI患者预后不良的AUC为0.784，并以出院前1 d miR-124≤1.41为预后不良的判断标准进行组外验证，结果显示，miR-124预测TBI患者预后不良的灵敏度为80.00%，特异度为80.76%，准确度为80.56%，证实miR-124在预测TBI患者预后中具有重要价值。

综上所述，TBI患者入院时外周血miR-124水平明显升高，且与损伤程度呈正相关，其是TBI患者预后的独立影响因素，可为临床预后评估提供参考。